疏水作用FPLC一步法制备级纯化抗人肝癌单抗HAb18 F

0　引言　抗人肝癌单抗HAb18标记放射性同位素用于肝癌患者的导向诊断和治疗已取得很好的效果. F(ab’)₂片段以其分子质量小、穿透力强、能进入实体肿瘤组织、不易引起过敏反应、血本底清除快等优点在基础研究和临床应用中已逐渐取代全抗，国内外文献^［1-5］曾先后报道了mAb不同亚类的F(ab’)₂片段制备和纯化方法，但这些方法或是制备周期长，或是产率低，或是纯度低，不符合人用质量标准，因此建立一种简便、高效、安全、实用的制备及纯化方法非常重要. 我们用结晶胃蛋白酶在适宜的条件下消化经硫酸铵盐析的HAb18腹水抗体，然后用FPLC(快速蛋白液相色谱) Phenyl-Sepharose HP疏水柱纯化，对F(ab’)₂片段的产率、纯度、免疫活性、细菌和热原方面均进行了质控和检测，制备出了符合人用标准的高质量F(ab’)₂片段. 用该法制备的三批F(ab’)₂片段已通过中国药品生物制品检定所检定，其核素交联物已申报国家I类新药.

1　材料和方法

1．1　试剂　胃蛋白酶(结晶品，Sigma公司，催化活性51.677 μmol^.s^-1) 3 mol^.L^-1 Tris，抗鼠F(ab’)₂段荧光抗体(华美公司)；pH 5.0 50 mmol^.L^-1 NaAc+1 mol^.L^-1 (NH₄)₂SO₄ (A液)； pH 5.0 50 mmol^.L^-1 NaAc (B液). 缓冲液用无菌注射用水配制， 15磅30 min高压灭菌.
1．2　仪器　FPLC Waters 650E美国；色谱柱Phenyl-Sepherose HP柱(1.6 cm×10 cm)， Pharmacia瑞典，(用0.5 mol^.L^-1 NaOH 1 mL^.min^-1流速处理纯化系统30 min，无菌注射用水冲洗至pH 7.0左右)；薄层色谱扫描仪CS-9000 Shimaduz日本.
1．3　F(ab’)₂片段的制备　参考文献［6］的方法并加以改进，过程如下.
1．3．1　腹水粗纯化　HAb18腹水用pH 7.4 PBS稀释1倍后，用0.291 g^.L^-1硫酸铵盐析2次，收集沉淀，用pH 3.5 0.1 mol^.L^-1柠檬酸缓冲液溶解，离心除去不溶物质，调整蛋白浓度至10～20 g^.L^-1.
1．3．2　胃蛋白酶消化　将经过盐析的腹水抗体用胃蛋白酶消化，抗体起始浓度为10～20 g^.L^-1，胃蛋白酶用0.1 mol^.L^-1柠檬酸缓冲液溶解至1～2 g^.L^-1，将酶与抗体按比例混合后，37℃水浴，分别于不同消化时间取样，加入1/10体积3 mol^.L^-1 Tris调整pH值至7.0左右以终止反应，用SDS-PAGE电泳检测抗体消化情况.
1．3．3　Phenyl-Sepharose HP柱纯化F(ab’)₂片段　终止反应后的胃蛋白酶消化液用0.361 g^.L^-1的硫酸铵盐析，沉淀用含1 mol^.L^-1硫酸铵pH 5.0 50 mmol^.L^-1的醋酸钠(A液)溶解后上柱纯化，Phenyl-Sepharose HP柱用相同缓冲液平衡，硫酸铵浓度由1 mol^.L^-1-0线性离子梯度洗脱，流速4 mL^.min^-1.
1．4　F(ab’)₂片段纯度测定　F(ab’)₂片段(1 g^.L^-1)在还原、非还原条件下行SDS-PAGE电泳，电泳结果经考马斯亮蓝R-250染色后，用薄层色谱扫描仪扫描，根据F(ab’)₂片段占所有区带总面积的百分比计算F(ab’)₂片段的纯度.
1．5　F(ab’)₂片段免疫活性测定　采用间接免疫荧光法. F(ab’)₂片段(1 g^.L^-1)用pH 7.4，10 mmol^.L^-1 PBS倍比稀释为1∶2000, 1∶4000, 1∶6000, 1∶8000, 1∶12 000, 1∶16 000，滴加在肝癌细胞涂片上，常规方法染色，荧光显微镜下观察结果. 阴性对照为PBS，阳性对照为消化前IgG.
1．6　F(ab’)₂片段细菌、热原质检测　F(ab’)₂片段(1 g^.L^-1)用RPMI-1640培养液(含150 mL^.L^-1小牛血清）培养72 h，倒置显微镜观察有无细菌生长，热原质检测采用鲎试剂法.
1．7　F(ab’)₂片段回收率　纯化后的F(ab’)₂片段用Lowry’s法测定蛋白含量，根据下述公式计算得率及回收率

2　结果

2．1　HAb18 IgG消化结果　SDS-PAGE电泳结果见图1，随着消化时间的延长，IgG逐渐减少而转变为相应的F(ab’)₂片段，消化2 h，约95%以上的IgG被裂解为F(ab’)₂片段.

图1　胃蛋白酶消化HAb18 IgG非还原条件下的100 g^.L^-1 SDS-PAGE电泳图

2．2　F(ab’)₂片段纯化结果及纯度测定　胃蛋白酶消化液经Phenyl-Sepharose HP柱纯化图谱见图2， F(ab’)₂片段约在60%～70%的B液出峰，对应盐离子浓度为0.4～0.3 mol^.L^-1. SDS-PAGE电泳结果(图3)显示，F(ab’)₂片段相对分子质量(M_r)为100×10³～110×10³，还原后为2条区带， 重链约26×10³～28×10³， 轻链约23×10³， F(ab’)₂片段纯度为98.8%.

图2　FPLC Phenyl-Sepharose HP柱纯化HAb18 F(ab’)₂片段色谱图

图3　3批F(ab’)₂片段经Phenyl-Sepharose HP柱纯化后的SDS-PAGE电泳图
1. Marker； 2.3.4. F(ab’)₂纯化(reducing)； 5.6.7. F(ab’)₂纯化(non-reducing).

2．3　F(ab’)₂片段免疫活性　间接免疫荧光法测定F(ab’)₂片段免疫活性为1∶8000，比消化前IgG略有降低.
2．4　F(ab’)₂片段得率及回收率　HAb18腹水中IgG的质量浓度约10 g^.L^-1［1］，投入50 mL腹水，IgG含量约500 mg，经胃蛋白酶消化后获得F(ab’)₂片段215 mg，实际得率为43%，mAb完全消化为F(ab’)₂的最大理论产率为66%. 根据计算， F(ab’)₂片段的回收率>50%.
2．5　F(ab’)₂片段细菌及热原质检测结果　F(ab’)₂片段培养72 h，镜下未见细菌生长，鲎试剂法检测热原质为阴性.

3　讨论　mAbF(ab’)₂片段由于不含有Fc段，减少了过敏反应和非特异性交叉反应的机率，因而在肿瘤患者的诊断和治疗方面较之全抗有更多的优越性. 国内有文献［1， 2］报道，用半胱氨酸、2-硫苏糖醇等还原剂激活木瓜蛋白酶，消化mAb IgG1亚类，木瓜蛋白酶(m)：抗体(m)为1∶10～1∶20，消化时间为4～8 h. 消化率可达90%～95%，但此法不足之处在于要消耗相对大量的木瓜蛋白酶，且多增加一步酶激活步骤，用于木瓜蛋白酶消化的IgG还需前期制备而不能直接消化腹水或细胞培养上清，整个制备周期耗时较长. 我们采用Sigma公司进口的结晶胃蛋白酶37℃条件下对酶与抗体比例、消化时间进行摸索，成功地将95%以上的IgG裂解为F(ab’)₂片段. 这说明用胃蛋白酶直接消化经粗纯化的腹水或细胞培养上清制备F(ab’)₂片段的方法完全可行，与国外文献［3］的结论相一致，其优越性在于大大缩短制备周期，简化操作程序，提高产率.
　　在pH 3.5环境下用胃蛋白酶消化含有mAb IgG1的小鼠腹水，除了IgG1以外，几乎所有的蛋白质均被降解为小分子肽段，因此可以从相对粗制的IgG样品中制备IgG1-F(ab’)₂片段纯品，而纯化方法的选择十分重要. 我们参考了国外文献有关F(ab’)₂片段的纯化方法，并对几种常用纯化方法进行了尝试. Parham^［4］用Sephadex G-200, -150, -100柱(100～150 cm)纯化F(ab’)₂片段，结果该系列凝胶柱对木瓜蛋白酶、Fab和Fc段有较好的分辨率，却不能将未消化的IgG分开. 我们用Sephacryl S-200（1 cm×65 cm）凝胶柱对F(ab’)₂片段进行了纯化，结果与Parham的报道相同. 我们还曾用DEAE Sepharose-FF阴离子柱纯化F(ab’)₂片段^［5］，结果是：阴离子交换柱虽可将未消化的IgG和木瓜蛋白酶基本除去，但却不易将F(ab’)₂片段与Fab及其他小分子片段很好地分开，F(ab’)₂片段纯度为91.7%. 因此，单独使用离子交换或分子筛均难以制备出高纯度(>95%)的F(ab’)₂片段. 近年来，高效疏水作用色谱在细胞工程，基因工程，酶工程和单抗的制取方面的应用取得了满意的效果. 研究表明^［6］：疏水柱基本不破坏蛋白质的三级结构，活性蛋白质用疏水作用色谱分离和纯化较为理想. 我们参考Morimoto等^［7］人的疏水柱纯化法加以改进，用FPLC Phenyl-Sepharose HP疏水柱(1.6 cm×10 cm)纯化F(ab’)₂片段，选择含1 mol^.L^-1硫酸铵pH 5.0 50 mmol^.L^-1的醋酸钠作为起始缓冲液(A液)，使胃蛋白酶和其他小分子片段从穿过峰中流出，而F(ab’)₂片段吸附在柱上，然后降低A液中硫酸铵的浓度，由1 mol^.L^-1～0线性离子梯度洗脱，获得了高纯度的F(ab’)₂片段. 该柱结合效率高，每次纯化可达制备水平，且纯化条件稳定，结果重复性好. 用该柱一步纯化mAbF(ab’)₂片段实为一种简便，高效且实用的制备方法.
　　另外，根据中国药品生物制品检定所制定的“人用鼠源性单克隆抗体制备及质量控制要点”，用于人体的F(ab’)₂片段除要求有较高的特异性、免疫活性及大于95%的纯度外，还必须无菌、无热原，而目前F(ab’)₂片段的制备方法步骤多、周期长，很容易被细菌污染产生热原质，给临床应用造成限制. 采用本法可使制备周期缩短一半，从而有利于质量控制. 本实验所用试剂及物品均灭菌处理，色谱柱经化学法消毒. 加之有研究认为，疏水色谱填料有去除细菌内毒素的作用. 结果经多环节的质量控制，有效地防止了细菌和热原质的产生. 用该法制备的3批F(ab’)₂片段经中国药品生物制品检定所检定，其纯度、免疫活性、细菌、热原质等指标均符合国家标准.

基金项目：国家863课题［863-102-12(1)］
作者简介：余晓玲(1972-)，女(汉族)，陕西省汉中市人. 助理实验师. Tel.（029）3374547　Email. xiaolingyu@163.net
余晓玲（第四军医大学基础部病理学教研室863课题组，陕西 西安 710033）
米力（第四军医大学基础部病理学教研室863课题组，陕西 西安 710033）
陈志南（第四军医大学基础部病理学教研室863课题组，陕西 西安 710033）

参考文献

［1］仇　凯，陈志南，刘智广et al. 木瓜蛋白酶制备抗人肝癌单抗F(ab’)₂及Fab片段［J］. 第四军医大学学报， 1995;16(6):414-417.
［2］于鲁东，蒋先敏，程　明et al. 应用木瓜蛋白酶消化抗甲胎蛋白单克隆抗体制备F(ab’)₂片段［J］. 中国生物制品学杂志， 1994;7(4):148-150.
［3］Parham P. On the fragmentation of monoclonal IgG1, IgG2a, and IgG2b from Balb/c mice ［J］. J Immunol， 1983；131(6): 2895-2902.
［4］Parham P. Monoclonal antibodies: Purification fragments and application to structural and functional studies of class I MHC antigens ［J］. J Immunol Methods，1982;53(1): 133-139.
［5］刘成刚，陈志南，边惠洁et al. 单克隆抗体F(ab’)₂片段两种纯化方法的建立及比较［J］. 第四军医大学学报， 1998；19(4):388-390.
［6］师治贤，王俊德. 生物大分子的液相色谱分离和制备［M］. 第2版. 北京 ：科学出版社，1996：223-226.
［7］Morimoto K, Inouye K. Single-step purification of F(ab’)₂ fragments of mouse monoclonal antibodies (IgG1) by hydrophobic interaction high performance liquid chromatography using TSKgel Phenyl-5PW ［J］. J Biochem Biophys methods，1992；24:107-117.