近几十年来，研究人员一直把
癌症看作是一种
遗传疾病，许多人都把研究重点放在确定突变分子生物学和癌症之间的关系上。自上世纪80年代以来，在关注基于序列的可遗传的变化方面的研究取得了一些进展。同时，表观遗传学领域也日益显露出勃勃生机，该领域关注的是与序列无关的那些遗传变化。
南加州大学Keck医学院Norris
肿瘤综合中心PeterLaird副教授认为，表观遗传学研究领域是一匹真正的黑马。他说：“许多研究人员还没有真正的从事表观遗传学的研究。”在基因组中除了DNA和RNA序列以外，还有许多调控基因的信息，它们虽然本身不改变基因的序列，但是可以通过基因修饰，蛋白质与蛋白质、DNA和其它分子的相互作用，而影响和调节遗传的基因的功能和特性，并且通过细胞分裂和增殖周期影响遗传，这些都属于表观遗传学研究的范畴。
PeterLaird表示，表观遗传学帮我们解释了许多疑问，例如，为何肝细胞的功能与脑细胞的不一样，虽然它们都是由同一个受精卵发育衍生而来的。因此，在控制细胞行为，包括与癌症有关的控制细胞行为方面，表观遗传学扮演了重要的角色。实际上，许多表观遗传学领域早期发表的文章都试图阐述肿瘤中发现的表观遗传变异情况。
但是直到20世纪90年代，研究人员才开始研究癌症细胞的甲基化变化。令人惊讶的是，人们并没有去研究癌症和这些变化之间的因果关系，是Laird等人首开先河，决定更直接的去研究这种因果关系。例如，在Laird的研究中，他选取了非癌性细胞，包括DNA甲基化作用，然后思考这些变化在癌症中的效应。
Laird说：“我开始研究这些甲基化作用，分析它们仅仅是副产品，还是真正的原因所在。我在1995年发表的一篇文章中阐述了我的研究结果：抑制小鼠的甲基化作用，就能完全阻止人结肠直肠癌小鼠模型形成肠息肉。”
聚焦DNA甲基化
DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一。随着对甲基化研究的不断深入，各种各样甲基化检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求。
通常来说，DNA甲基化发生在DNA启动子区域的胞嘧啶残基上，尤其是在CpG岛上，绝大多数正常细胞中的基因是不会形成甲基化胞嘧啶核苷酸的，目前认为CpG岛甲基化导致转录抑制是恶性肿瘤发生的重要机制之一，细胞中的甲基转移酶催化了甲基化的形成。
约翰霍普金斯大学肿瘤学教授StephenBaylin表示，在每一种人类癌症疾病中，都能发现超甲基化基因，包括液体肿瘤和固体肿瘤。然而，研究甲基化和癌症之间的关系，不在于癌症细胞是否有甲基化基因，而是要考虑与癌症有关的基因的数量以及不同的甲基化变异类型。
因为知道了这些基因的准确位置，就可以采用一种敏感方式――针对肿瘤检测的一种极其有效的生物标记策略――去进行检测。这种策略对风险评估也很有用，因为可以在癌症发育的前期阶段，看到肿瘤上的表观变化。Laird认为，DNA甲基化作为一种早期检测理论，还有许多优点。通过检测体液如血液中的肿瘤DNA，能观察到异常的DNA甲基化模式。但是检测甲基化也并非易事。在上世纪70年代的SouthernBlotting实验中，早期检测方法需要依靠甲基化敏感限制性酶，如HpaII。
在上世纪80年代期间，研究的主要方法是PCR和克隆，两者都不涉及甲基化内容，因此很快就被弃用了。90年代，Laird开发了两类技术去检测肿瘤细胞中的甲基化模式，MethylLight和COBRA，两者都是以甲基化胞嘧啶的脱氨作用（将胞嘧啶转化为尿嘧啶残基）以及通过分析方法鉴定修改的序列为基础。
结合重硫酸盐限制性分析法(COBRA法)是由Laird于90年代晚期开发的。这种方法对DNA样品进行重亚硫酸盐处理及PCR扩增，处理后原甲基化的胞嘧啶被保留，而非甲基化的胞嘧啶变为胸腺嘧啶。随后用限制性内切酶对转化后PCR产物切割的特性，识别原标本DNA的甲基化状况。最终对非甲基化敏感的序列进行分析，COBRA方法中使用的限制性酶可以对重硫酸盐处理后诱导的序列变化进行识别。1999年，Laird开发了第二种方法MethylLight，用重亚硫酸盐处理待测DNA片段，然后用特异性实时荧光定量PCR(TaqManPCR)反应进行扩增，识别完全甲基化的序列。Methy—Light是一种高度敏感的分析方法，能够在未甲基化等位基因超出1万倍的情况下检测到甲基化的等位基因；非常精确地检测特定DNA甲基化模式的相对丰度，只需少量的模板DNA。
Laird表示，需要不断改进相关技术，提高灵敏度，才能更好的对癌症细胞中的甲基化模式进行研究。幸运的是，加州的Illumina公司为此开发了特定的分析方法。Illumina公司在早期的分析方法金门分析法（TheGoldenGateAssay）基础上改良了新的甲基化分析方法。主要差异在于：GoldenGate分析是三探针设计，而甲基化分析是四探针设计。
Illumina公司的甲基化产品经理VivianZhang说：“就工作流程来说，它们基本上是相同的，只需要对上游的DNA样本进行重亚硫酸盐转变，然后将其加入GoldenGate工作流程平台即可。”
新的甲基化分析方法工作原理如下：重亚硫酸盐处理可以将未甲基化的胞嘧啶残基转换为尿嘧啶，而对已经甲基化的胞嘧啶则不起作用。在研究过程中，研究人员特意为基因组中的每一个CpG岛设计了等位基因特异性寡核苷酸(ASO)和基因座特定寡核苷酸(LSO)两对探针，当探针与处理过的DNA杂交时，就会得出很高的特异性分析结果。甲基化分析最大的优势在于，它能在一个反应中与多达1,536个CpG岛反应，实现对甲基化特异性PCR方法的竞争，后者曾被看作甲基化模式的金标准，但它一次只能测量一个基因。
因为ASO和LSO探针在基因组中的杂交非常接近，连接作用之后就会发生扩散，连接作用将两个探针连接在一起，使得它们进行PCR的定向扩增。之后，PCR利用荧光标记的通用引物对连接产物进行扩增，并且将PCR产物与Illumina公司的珠阵列技术杂交。对来自每一个结合产物的荧光进行测量，结果可以用于确定一个CpG位置是完全甲基化，半甲基化，还是未甲基化。甲基化分析的结果称作β，是以荧光信号Cy3（绿色）于Cy5（红色）之比计算得出的结果，如果全部都是绿色信号，表示未甲基化，而全为红色则表示完全甲基化。
表观遗传学的目标
虽然有许多方法可以对一种特异性的甲基化基因进行精确检测，但还不能证明它就是引起癌症的原因。Baylin说道：“当你看到这些基因中的甲基化现象，你必须进一步去证明这些基因就是引起癌症的原因，或者证明它们在这一过程中起了重要作用。”换句话说，研究人员必须证明这些功能的中断，或者是通过遗传上的突变，或者是通过表观上的DNA甲基化或染色质修饰，导致癌症的发生以及进一步恶化。对表观遗传学来说，这是一个巨大的挑战。
另一个主要的挑战是了解癌症细胞中异常基因表达的逆转过程。Baylin认为，采用一些表观治疗策略，使那些肿瘤抑制基因再次出现逆转是可能实现的。目前，一些大型制药公司与学院研究人员一起合作，以确定这种方法是否可以作为癌症治疗的方法。
实际上，美国FDA已经批准了以抑制表观机制为原理的抗癌试剂。SuperGen公司首席科学家DavidBearrs称：“根据DNA甲基化和癌症发育之间的相互关系，我们正在开发特异性的，有效的癌症治疗方法。”SuperGen公司购买了MGI制药公司的骨髓增生异常综合征治疗药物地西他滨（decitabine，Dacogen）的全球独家许可权，期望开发出新的治疗方法。
地西他滨属于DNA甲基转移酶抑
制剂，针对的是DNA甲基化酶，该酶催化甲基团使其添加到胞嘧啶残基的C-5位置。地西他滨药物是一种胞嘧啶类似物，在复制细胞中掺入到DNA链中，替代正常的胞嘧啶。经过修饰后，DNA甲基转移酶不能使这种类似物(2-脱氧，5-氮杂胞嘧啶)甲基化。Bearrs称：“我们的目的是去了解，作为一种癌症治疗方法，我们如何影响甲基转移酶持续途径，即使是癌症期间胞嘧啶残基的新生甲基化过程。”
采用地西他滨的类似药物，对肿瘤细胞可能产生多效性。也就是不止针对一种蛋白质或者途径。尤其，采用低甲基化试剂如地西台宾，通过关闭DNA甲基化作用，已经可以定靶于肿瘤抑制基因的表达。Bearrs说：“因此，如果我们能通过抑制DNA甲基化，将癌症细胞中的那些基因逆转过来，我们就能在逆转致癌表型的实验中获得阳性结果。”
因此，FDA只允许地西他滨用于骨髓增生异常综合症的治疗，该疾病是髓性白血病的前体。然而，Bearrs认为，地西他滨不仅仅只限于液态肿瘤的使用，与地西他滨类似的药物已经用于固态肿瘤的研究。他预测，这些研究中的低甲基化试剂很可能与其他的复合物结合使用，如组蛋白脱乙酰基酶抑制剂可以阻断表观事件，而另一种调节机制――组蛋白脱乙酰作用能活化特殊基因的表达。
（译自《Genomics&Proteomics》）
作者：
2007-7-26