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摘 要 本文建立了应用固相萃取－高效液相色谱法（SPE-HPLC）测定饲料中磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺喹恶啉等五种磺胺类药物的方法。考察了氧化铝小柱的最大饱和容量及洗脱条件，优化了色谱条件：流动相为乙睛和水（25:75,v/v）,流速为1.0mL/min，检测波长为270nm。在优化条件下，方法检出限为0.1μg/mL，线性范围在0.2μg/mL～200μg/ mL之间，线性相关系数高于0.9996。将该方法用于鸡配合饲料、猪配合饲料和浓缩饲料中磺胺类药物残留的测定，不同添加浓度的回收率均高于80%，相对标准偏差≤10％，能够满足实际样品的分析要求。
关键词 固相萃取；高效液相色谱法；磺胺类药物；
1．引言
磺胺类药物（Sulfonamides, SAs）都具有对氨基苯磺酰胺结构，广泛用于预防和治疗细菌感染性疾病。集约化养猪场常用抗生素药物混入饲料中防治疫病,磺胺类药物其比例一般是:预防量100—200PPM,治疗量300-500PPM。
磺胺类药物的测定方法报导的文献有很多，基本上都是用高效液相色谱或液质的方法测定动物组织、血液、蛋、奶、蜂蜜中的7-11种磺胺。过程相差不大：有机相除蛋白→乙睛提取→碱性氧化铝SPE柱净化→浓缩→高效液相色谱紫外检测（或柱后衍生，荧光检测）或高效液相色谱-质谱检测。由于饲料样品成分的多样性和复杂性使得测定其中磺胺类药物难度较大，文献报导也较少。在这篇文章中，我们详细的阐述了用乙腈作为提取剂、通过碱性氧化铝SPE小柱净化后反相高效液相色谱仪紫外检测器检测饲料产品中五种磺胺的残留量。
2．实验部分
2.1仪器
WATERS600型高效液相色谱仪，C18色谱柱（5µm ，250mm×4.6mm）。选用乙睛和水作为流动相，乙睛和水体积比例为25:75,流动相的流速为1.0mL/min；WATERS474二极管阵列检测器,波长为270nm；WATERS 717plus 自动进样器，进样量 为 20µL。
2.2 试剂及材料
乙腈和甲醇为色谱纯（Fisher公司）；冰醋酸为优级纯（国产）；其它试剂为分析纯，国产，
未进一步处理直接使用。磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺喹恶啉标准品（Sigma公司，纯度>99%）；碱性氧化铝SPE 小柱:Speed SPE Cartridges Alumina Basic ALB (ABI公司) ，规格为1000mg/12mL；
2.3 标准溶液的配制
分别配制五种磺胺的标准贮备液，浓度为1mg/mL，乙腈溶解（注：磺胺喹恶啉用甲醇溶解）。－20℃冰箱保存一个月。标准工作液现用现配，用流动相定容。
2.4 样品前处理
2.4.1提取 称取配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料样品2g，置于具塞锥形瓶中，加入50 mL的乙睛于振荡器振荡提取30min，过滤，滤液备用。
2.4.2 净化 准确吸取试液(２.4.1)：配合饲料10～20mL；浓缩饲料、添加剂预混合饲料2 mL,移入用10mL乙睛淋洗过的碱性氧化铝小柱中,令其自然流速流出。待试液全部流出后，吹干，用两次2mL流动相洗脱，收集洗脱液, 并过0.45um的滤膜，滤液上机测定。
3.结果与讨论
3.1色谱条件的优化
考察了乙睛+水+冰乙酸流动相体系，结果如图所示（见下图）。通过色谱图可知，在乙睛，水和冰乙酸体积比为75：25：3时最为适宜。在此条件下，五种磺胺类药物能够达到基线分离。另外，金霉素、青霉素等药物对其无干扰。
3.2 分析性能
在优化条件下，磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺喹恶啉等五种磺胺类药物在0.2～200μg/mL浓度范围内，浓度与响应强度具有良好的线性关系，线性相关系数高于0.999，相对标准偏差（RSD）小于5%。结果见表2：
|
目标分析物 |
回归方程 |
线性范围 |
线性相关系数 |
LOD |
RSD |
|
磺胺嘧啶 |
Y=0.0796+0.0000222x |
0.2-200 μg/mL |
0.9999 |
5mg/kg |
1.05% |
|
磺胺二甲基嘧啶 |
Y=0.074+0.0000249x |
0.2-200 μg/mL |
0.9999 |
2mg/kg |
2.34% |
|
磺胺间甲氧嘧啶 |
Y=0.0123+0.0000254x |
0.2-200 μg/mL |
0.9999 |
5mg/kg |
2.35% |
|
磺胺甲恶唑 |
Y=-0.0220+0.0000241x |
0.2-200 μg/mL |
0.9999 |
2mg/kg |
0.88% |
|
磺胺喹恶啉 |
Y=0.456+0.0000300x |
0.2-200 μg/mL |
0.9996 |
2mg/kg |
1.26% |
3.3 样品的前处理
3.3.1 提取剂的选择
饲料组成极为复杂，对磺胺类药物的提取和测定干扰较大。在本研究中，考察了甲醇、70%酸性甲醇、乙睛和95%乙睛水四种提取剂的提取效果及对测定的影响。结果如图所示。
由图可知以甲醇和70％的酸性甲醇为提取剂时，色谱图基线不平，可能影响样品的测定。而95%乙
睛水对碱性氧化铝小柱具有穿透作用，使得目标分析物流失。因此，选择乙睛作为提取剂。
3.3.2 碱性氧化铝小柱饱和容量
考察了氧化铝小柱的最大饱和容量，将标准溶液10μg/mL分别上柱2 mL、5 mL、10 mL、20 mL、30 mL，结果如表3所示。由表中结果可知，碱性氧化铝小柱对磺胺类药物的承载量小于200μg。而磺胺类药物在配合料中的添加量约为100～200mg/kg，在添加剂预混合饲料中大于1000mg/kg，在称样量为2g时，配合饲料上样量定为10mL；添加剂预混合饲料上样量定为2mL。
表3 碱性氧化铝SPE小柱穿透性结果—下滴液中SAs百分率
|
上柱浓度（mg） |
20 |
50 |
100 |
200 |
300 |
|
磺胺嘧啶 |
/ |
/ |
/ |
1.4 |
17.2 |
|
磺胺二甲基嘧啶 |
/ |
/ |
/ |
5.7 |
42.0 |
|
磺胺间甲氧嘧啶 |
/ |
/ |
/ |
/ |
9.7 |
|
磺胺甲恶唑 |
/ |
/ |
/ |
2.5 |
24.2 |
|
磺胺喹恶啉 |
/ |
/ |
/ |
3.0 |
27.7 |
3.3.3 洗脱剂的选择
考察了75%乙睛水、25%乙睛水和纯水三种洗脱液，每次用2mL洗脱液，洗脱3次，结果见表4。由表中结果可知，75%的乙睛水洗三次后仍有个别磺胺类药物未被洗脱；而25%乙睛水、纯水在三次洗脱后，洗脱液中已无任何磺胺类药物。由于25%的乙睛水恰恰是流动相的组成，因此确定用25%的乙睛水2mL洗脱两次
表4 洗脱剂的选择—不同洗脱剂分次洗脱百分率（%）（100ng标准溶液）
|
洗脱剂 |
75%乙睛水 |
25%乙睛水 |
水 | |||||||
|
1 |
2 |
3 |
1 |
2 |
3 |
1 |
2 |
3 | ||
|
磺胺嘧啶 |
65 |
34.6 |
2.4 |
100 |
/ |
/ |
100 |
/ |
/ | |
|
磺胺二甲基嘧啶 |
92.2 |
9.4 |
/ |
100 |
/ |
/ |
100 |
/ |
/ | |
|
磺胺间甲氧嘧啶 |
84.1 |
17.4 |
/ |
100 |
/ |
/ |
100 |
/ |
/ | |
|
磺胺甲恶唑 |
88.6 |
14.6 |
1.3 |
100 |
/ |
/ |
100 |
/ |
/ | |
|
磺胺喹恶啉 |
93.9 |
11.2 |
/ |
100 |
/ |
/ |
100 |
/ |
/ | |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
3.4 样品的测定
将该方法用于鸡配合饲料和猪配合饲料中磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺喹恶啉等五种磺胺类药物的测定。考察了20μg/mL、100μg/mL、200μg/mL和400μg/mL浓度水平加标回收，回收率结果见表5。在鸡配合饲料中，四个浓度水平的磺胺类药物的回收率高于77.7%，RSD≤；在猪配合饲料中，四个浓度水平的磺胺类药物的回收率高于80.2%，RSD≤；由于在猪浓缩饲料中磺胺类药物添加量较高，因此只考察了一个浓度水平的回收率，结果见表6。
表5（1） 鸡配合饲料中五种磺胺类药物的回收率
|
|
20 mg/kg |
100 mg/kg |
200 mg/kg |
400 mg/kg | ||||
|
回收率(%) |
RSD (%) |
回收率(%) |
RSD (%) |
回收率(%) |
RSD (%) |
回收率(%) |
RSD (%) | |
|
磺胺嘧啶 |
99.3 |
6.9 |
78.5 |
6.0 |
81.3 |
2.0 |
90.0 |
1.6 |
|
磺胺二甲基嘧啶 |
101 |
5.9 |
87.3 |
2.9 |
82.1 |
3.0 |
89.9 |
2.2 |
|
磺胺间甲氧嘧啶 |
99.2 |
6.0 |
77.7 |
4.4 |
85.3 |
2.8 |
80.4 |
1.0 |
|
磺胺甲恶唑 |
95.3 |
5.1 |
87.3 |
3.8 |
87.8 |
3.7 |
85.5 |
0.99 |
|
磺胺喹恶啉 |
98.3 |
8.0 |
86.9 |
7.0 |
90.4 |
4.0 |
90.3 |
2.7 |
表5（2） 猪配合饲料中五种磺胺类药物的回收率
|
|
20 mg/kg |
100 mg/kg |
200 mg/kg |
400 mg/kg | ||||
|
回收率(%) |
RSD (%) |
回收率(%) |
RSD (%) |
回收率(%) |
RSD (%) |
回收率(%) |
RSD (%) | |
|
磺胺嘧啶 |
101 |
7.9 |
80.2 |
4.7 |
88.2 |
2.1 |
89.7 |
1.0 |
|
磺胺二甲基嘧啶 |
105 |
4.2 |
82.4 |
3.3 |
87.7 |
2.8 |
83.2 |
0.56 |
|
磺胺间甲氧嘧啶 |
100 |
6.6 |
80.4 |
2.9 |
86.8 |
1.9 |
87.5 |
1.2 |
|
磺胺甲恶唑 |
91.5 |
4.1 |
89.8 |
4.3 |
80.4 |
2.0 |
82.1 |
2.3 |
|
磺胺喹恶啉 |
104 |
8.7 |
89.1 |
5.0 |
87.4 |
3.6 |
88.8 |
1.8 |
表6 猪浓缩饲料中磺胺类药物的回收率
|
|
添加量(mg/kg) |
测得量(mg/kg) |
回收率(%) |
RSD(%) |
|
磺胺嘧啶 |
400 |
325.2 |
81.3 |
4.4 |
|
磺胺二甲基嘧啶 |
400 |
377.2 |
94.3 |
6.3 |
|
磺胺间甲氧嘧啶 |
400 |
392.8 |
98.2 |
2.9 |
|
磺胺甲恶唑 |
400 |
372.0 |
93.0 |
3.5 |
|
磺胺喹恶啉 |
400 |
384.4 |
96.1 |
7.7 |
4 结论
高效液相色谱法测定饲料中磺胺类药物，方法简单、易于操作，准确度、精密度均符合要求。该方法适用于配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料中磺胺类药物的检验。
5参考文献
1 GB/T19542-2004“饲料中磺胺二甲基嘧啶和磺胺间甲氧嘧啶的测定 高效液相色谱法”；
2 NY5029-2001 无公害食品 猪肉 附录E 磺胺类药物在动物可食性组织中的高效液相色谱检验；
3 Kristof E.Maudens, Quantitative analysis of twelve sulfonamides in honey after acidic hydrolysis by high-performance liquid chromatography with post-column derivatization and fluorescence detection. Journal of Chromatography A,1047(2004) 85-92
4 John D. Weber, liquid chromatography determination of sulfamethazine in milk ,J.ASSOC.OFF.ANAL.CHEM(VOL.72,NO.3,1989)
5 Joe O.Boison ,Determination of Sulfadimethoxine and Sulfamethazine Residues in animal tissues by liquid chromatography and thermospray Mass spectrometry , Journal of AOAC, VOL 78,NO.3, 1995