RP-HPLC法测定人血浆中格列齐特浓度色谱分析实例 | 39康复网

　（浙江省丽水市中心医院　丽水　323000）

摘要：本文采用反相高效液相色谱法测定人血浆中格列齐特浓度。固定相：ODS-C18；流动相∶乙腈-甲醇-水（35∶20∶45）的混合溶液，并用磷酸调节pH至3．5；流速：1．0 ml.min^－1；紫外检测波长：228 nm；方法回收率大于95％，日内、日间相对标准偏差小于8％。血浆的最低检测限为0．05 μg.ml^－1；线性范围：0．5～12 μg.ml^－1，r＝0．9995。

Determination of Gliclazide in Human Plasma by RP-HPLC
FAN Yue （Lishui Center Hospital，zhejiang 323000）

ABSTRACT：A reverse phase RP-HPLC method has been successfully used to determine Gliclazide in plasma．Ananalytical column was packed with ODS-C18．The mobile phase was acetonitrile—methanol—water（35∶20∶45）（and phosphate is used to adjust pH＝3．5，flow rate of 1.0 ml.min^－1 UV detection was performed at 228nm．The average recovery was ＞95％．The respense value was linear between 0．5 μg.ml^－1～12 μg.ml^－1 and r was 0．9995
KEY WORDS：Gliclazide；RP-HPLC；Plasma drug concentration

格列齐特（Gliclazide，GL）系第二代磺酰脲类口服降血糖药。它不仅能降低血糖，而且能够改善或延缓糖尿病血管并发症的发生与发展，临床主要用于非胰岛素依赖型糖尿的治疗［1］。由于格列齐特临床疗效不稳定：一方面是因为GL临床用药的个体差异大；另一方面GL同一剂型不同厂家生产其疗效也有显著差异。故本文建立了用反相高效液相色谱法测定人体内GL血药浓度的方法，为临床治疗、药物检测和药物动力学研究提供理论依据。
1　材料与仪器
1．1　药品与试剂　格列齐特标准品由上海医药工业研究院提供，甲醇、乙腈系色谱纯级，磷酸、苯、盐酸为分析纯试剂，水为去离子重蒸馏水（用前过滤）。
1．2　仪器　瑞士Kontron公司出品KONTRON经济Ⅱ型高效液相色谱仪，包括322型检测器，322型进样器，MICRO-LITER＃702
1．3　色谱分析条件　ODS柱（dp 5μm Φ4．6×25 cm）。
流动相：乙腈-甲醇-水（35∶20∶45）混合溶液，并用磷酸调节pH至3．5（用前超声脱气30 min），流速1 ml.min^－1，紫外检测波长：228 nm，检测灵敏度0．01 AUFS。
1．4　标准品溶液的配制　精确称取干燥至恒重的GL纯品10 mg，置100 ml容量瓶内，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得100 μg.ml^－1 GL储备液，低温储存备用。
1．5　样品预处理　取血浆1．0 ml加入一定量的GL储备液（100 μg.ml^－1），加盐酸（0．05 mol.L^－1，pH＝1．5）1 ml，漩涡混合10 s，用苯3 ml分次振荡，离心300转／min，10 min提取，合并提取液于一尖底具塞离心管内，45℃水浴，井式减压挥发蒸干，残留物用甲醇1 ml溶解并离心（300 r.min^－1），取上清液20 μl进样。血浆色谱图（见图1）。

2　结果
2．1　线性关系与灵敏度　取7支试管分别加空白血浆1．0 ml，1支试管作空白对照，另6支分别另入GL储备液使含GL为0．5、1．0、2．0、5．0、10．0、12．0 μg.ml^－1的浓度系列，按前法提取进样。以GL峰面积x为纵座标，相应浓度Y为横座标，作标准曲线（见图2）。其直线回归方程为：Y＝0．02 32x－0．04681（r＝0．9995）。

2．2　回收率　在同一血浆标本内加入不同量的GL标准溶液（100 μg.ml^－1），分别配成浓度为0．5、5、12 μg.ml^－1的样品，按前法提取进样得各浓度的平均峰面积。GL的绝对回收率（见表1）。
绝对回收率＝(A^-血样品)/(A^-标准品)×100％

（同一浓度）

表1　测定回收率结果（n＝3）

浓度（μg.ml^－1）	A^-±S			A°^－±S			（回收率％）	平均回收率（％）
0．5	24．977	±	0．7334	26．213	±	0．5948	95．3		96．3 （RSD ＝1．04％）
5	227．27	±	3．322	235．89	±	3．075	96．3
12	526．12	±	6．325	540．77	±	6．38	97．3

2．3　精密度　取3支试管，按血样品处理法分别配成浓度为0．5、5、12 μg.ml^-1的样品，分别提取进样，日内测定n＝6，日间测定n＝9（见表2）。
RSD＝（S／A^-）×100％
　　A^-＝平均峰面积，S＝标准偏差

表2　测定方法的精密度

浓度（μg.ml^-1）	日内SRD（％）	日间RSD（％）
0．5	2．77	2．52
5	2．01	2．50
12	1．13	1．17

从表1得出回收率为96．3％，从表2得RSD为2．02％，不超过8％。
3　讨论
3．1　从表1、2看方法回收率＞95％，日内、日间变异＜8％，说明提取方法可行，测定方法稳定性好。
3．2　实验中流动相改变3次：开始时乙腈-甲醇-水比例为30∶25∶45，出峰时间约15 min左右，时间较长。因为此实验是用反相高效液相色谱法测定。根据反相色谱法的原理：流动相极性大于固定相极性。故流动相极性增大，洗脱能力降低，t′_R增大；反之减小。为此我们加大了流动相中有机相的比例为2∶1∶2，出峰时间提前至7 min，但出现的杂质峰与样品峰连在一起分离不完全，故重新调整流动相比例为35∶20∶45，使药物出峰时间移至10 min左右，流动相条件确定佳。
3．3 pH的变化对提取回收率影响较大。本文研究证实，随着pH的升高回收率明显降低。原因可能为GL系一种磺酰脲类化合物，磺酰基和脲基上的氢具有一定的酸性（PKa分别为2．21和5．98）［2］，随着pH的升高可能解离成盐，极性增强而影响有机溶剂的萃取。因此，提取过程中加入适量酸液是必要的。
3．4　国内有文献［3］报道：RP-HPLC法测血浆中格列齐特浓度的分析方法中定量分析用内标法，内标物甲磺冰片脲（Glibornuride）系进口片剂用有机溶剂重新萃取结晶。而本实验用外标法则无需在试样溶液中加入在试样中不存在的元素，方法简便可行，但要求进样量准确及实验条件恒定。比较两组数据（见表3）。

表3　内标法和外标法的数据比较

定量方法	相关系数（r）	回收率（％）	相对偏差（％）
内标法	0．9995	97．8	2．7
外标法	0．9995	96．3	1．04

参考文献
［1］Holmes B，et al：Gliclazide a preliminary review of its pharmacodynamic properties and therapeutic efficacy in diabetes mellitus.Drugs,1984,27：301.
［2］Kimura M，et al：Determination of gliclazide in human serum by high-performance liquid chromatography using an anion-exchange resin，J Chromatogr Biomed Appl,1980,183：467.
［3］刘皋林等：RP-HPLC法测定血浆中格列齐特浓度,药物分析杂志,1994,14（1）：13.

作者： 2007-5-18