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[摘要] 目的：建立一快速、灵敏的对乙酰氨基酚(PAC)体内浓度的测定方法，并用于其生物利用度的研究。方法：以茶碱为内标，采用固相萃取的HPLC分析法，取样0.2ml。YWG-C18色谱柱，流动相为甲醇/乙腈/水(25/l5/360，V/V)，流速1.0ml/ min，检测波长254nm。结果：PAC的最低检测浓度为0.05ug/ml。线性范围0.20-15.0ug/ml。平均批内、批间RSD均<6,方法回收率接近1OO，RSD<5。结论：本方法快速灵敏、干扰少、重现性好，符合PAC生物利用度研究的要求。
[关键词]对乙酰氨基酚；高效液相色谱法；血浆样品
对乙酰氨基酚(paracetamlol,PAC)可升高痛阈而达到止痛目的，通过对下丘脑体温调节中枢产生作用而达到退热目的。适用于轻、中度疼痛，感冒引起的发热等。关于HPLC测定对乙酰氨基酚的文献报道很多，本研究在参考文献的基础上，采用C2固相萃取柱进行固-液萃取，建立了快速、简便、灵敏的分析法。
1材料与方法
1.1 仪器与试药 HPLC1OA系列(日本岛津)：泵 SPD-lOAD、检测器SPD-IOA。自动进样器SIL-1OA、数据处理器C-R7AeP1us、系统控制器SCL-1OA；固相柱萃取柱：Bond-ElutC2,l00mg/ml, Varian(美国)。PAC对照品(上海强生制药有限公司，批号990076R)；内标：茶碱(TP，复旦大学药学院药剂研究室，批号9600191)；乙腈、甲醇(美国 FisherHPI.C级)；Millipore超纯水制备仪(USA)。
1.2 色谱条件 YWG-C18色谱柱(10um,150mm X4.6mm)；0.5um过滤柱；流动相为甲醇/乙腈/水(25：15：360,V/V)；流速1.0ml/min；检测波长254nml；柱温20~25℃。保留时间：PAC为5.0 min，TP为6.9mine
1.3 血样预处理 固相萃取柱预先用甲醇(2X1血1)和蒸馏水1ml处理，蒸馏水勿抽千。取血样0·2 m1，上固相柱，真空抽千后高真空抽滤2mmn，用蒸馏水0·4ml清洗，真空抽干后高真空抽2mmn，弃去所有滤液，换上洁净接受管，用甲醇/水(60/40)溶液 0·8ml洗脱，收集洗脱液再加入内标200pl混合后，移至0·2m1聚丙烯离心管，置HPLC自动进样器中进样20ul.
2结果
2.1 方法评价
2.1.1 线性范围和检测灵敏度 配制浓度分别为 0·2、1·0、4·0、8·O.10.0.15.0ng/ml浓度的标准血浆样品各6管，每2管为1批，分3批，按血样测定方法操作，以PAC浓度(c)对PAC峰面积和内标峰面积比值(7)做线性回归，得方程y=0.01984+0.1192c,r=0.999l(w=6)。说明PAC在0.2~ 15.0ug/ml有很好的线性关系。最低检测浓度为0.05ug/ml，最低检测量0.2 ng(rSN=3)。标准色谱图见图1。
2.1.2 精密度和准确性 配制含PAC0.20、5.0、 12.0ug/ml的3种浓度标准血样各l8份，每种浓度批内各测6次，批间重复测定3次。结果0.20、5.0、 12.0ug/ml的批内RSD分别为2.875.07和 2.62；批间 RSD分别为 4.13、3.38和 2.47。方法回收率分别为100.7、97.3和 98.4，RSD分别为4.15、3.29和2.44。
2.1.3 提取回收率 配制含PAC0.2、5.0、12.0 ug/ml标准血样各6份，经提取后测定，结果PAC3种浓度的提取回收率分别为93.23、89.94和91.43。
2.2 样品稳定性试验 配制含PAC0.2、5.0、12.0 ug/ml标准血样，按血浆提取步骤操作后，置全自动进样器中，分别在0、1、5、10、12、16、24h测定。结果 3种样品在24h内浓度变化分别低于4%、2%和6%。
2.3 多次冻融试验 配制含PAC0.2、5.0、12.0 ug/ml的标准血样适量，即时测定；再冷冻保存，解冻测定，连续3次，结果经3次冻融后，样品浓度变化分别低于3%、1%和6%。
2.4 稀释试验 用空白血浆稀释PAC2种浓度 (5.0和12.0ug/ml))1倍后测定，测得浓度乘2后与实际配制浓度相比，分别是实配浓度的97和 94。
3 讨论
测定血浆中PAC，一般均采用液-液萃取，但该方法费时且溶剂造成空气污染。而我们采用C2固相萃取法，同时可处理20个样品，使提取方法更为简使、省时。固相柱再生后可反复使用，冲洗溶剂为甲醇、水。本法洗脱液可直接进样，省去了吹干的时间。
我们分别考察了氯仿、甲醇、水对PAC的洗脱能力，结果发现氯仿、甲醇均能将PAC洗脱下来。由于氯仿毒性大，故选用甲醇作洗脱液，并考察5、 10、50、60、70的甲醇水溶液的洗脱力，发现浓度在50以下对PAC洗脱不完全，而60以上能保证洗脱完全，考虑到溶剂的挥发性，选用60甲醇
水溶液作洗脱液。而水对PAC无洗脱力，选择水作清洗液。
服用常规剂量的PAC后，体内的PAC浓度为ug级，采用Bond-ElutC2固相柱，血样分析只需 0.2ml，这样可降低采血成本。另外，在实验中发现，如果内标与样品一起上柱后，洗脱下的内标量重现性较差，可能受固相柱吸附力的限制，因此采取内标液后加入洗脱液内，涡旋后进样。本法已应用于 PAC缓释片生物利用度研究。
标准曲线以往通过采用普通最小乘法获得，但这种方法往往使低浓度区域分析的结果相对误差甚大而不符合生物样品分析的要求。我们运用SPSS统计软件，采用加权最小二乘法，所获标准曲线使低浓度的偏差得到很大程度的改善，达到了生物样品的分析要求。