高效液相色谱法测定丁溴东莨菪碱有关物质的研究色谱分析实例 | 39康复网

目的：建立测定丁溴东莨菪碱有关物质的高效液相色谱法。方法：采用Waters Symmetry C₁₈色谱柱(5 μm,3.9 mm×150 mm)，以0 .001 mol*L^-1盐酸-甲醇(185∶340)配制的0.008 mol*L^-1十二烷基硫酸钠溶液为流动相，用DAD检测器于210 nm波长处测定。结果：丁溴东莨菪碱与其他莨菪碱峰完全分离，从而对主要的杂质氢溴酸东莨菪碱进行了限量检查。结论：此法操作简便、快速、准确、具有量化的优点。
关键词　高效液相色谱法　丁溴东莨菪碱　有关物质

　　丁溴东莨菪碱为抗胆碱药。生产本品的原料为托烷类生物碱，生产中的主要杂质为氢溴酸东莨菪碱。中国药典1995年版、BP1993年版、日本药局方(十二改正)均收载了该品种^［1～3］。中国药典1995年版采用了TLC法检查有关物质，但分离情况并不理想，主斑点拖尾现象较严重，与杂质斑点分离度欠佳。本文参照BP1993年版进行试验研究，拟用HP LC法检查有关物质，用外标法测定氢溴酸东莨菪碱，面积归一化法检测总杂质量^［4］。建立的HPLC法能使丁溴东莨菪碱与其他莨菪碱峰得到满意的分离，并对氢溴酸东莨菪碱进行了限量检查，操作简便、快速、准确。

1　仪器与试药

　　日本岛津UV-260型分光光度计，HP1100液相色谱仪，二极管阵列检测器。氢溴酸东莨菪碱对照品、丁溴东莨菪碱对照品和硫酸阿托品对照品由中国药品生物制品检定所提供；样品：丁溴东莨菪碱原料由成都市制药一厂提供，水为超纯水，甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2　实验方法与结果

2.1　色谱条件　色谱柱：Waters Symmetry C₁₈(5 μm,3.9 m m×150 mm;柱温：30℃；理论板数按丁溴东莨菪碱峰计，应不低于3 000；流动相：0.00 1 mol*L^-1盐酸-甲醇(185∶340)配制的0.008 mol*L^-1十二烷基硫酸钠溶液；流速：1.2 mL*min^-1；检测波长：210 nm;进样量：10 μL。
2.2　检测波长的确定　取丁溴东莨菪碱对照品适量，分别加流动相、甲醇溶解，于190～700 nm波长范围内进行扫描，在200及205 nm波长处有吸收。BP1993年版在 210 nm波长处测定本品的有关物质。根据溶剂的紫外截止极限波长和参考BP1993年版规定，选择210 nm作为检测波长。
2.3　流动相的确定　以氢溴酸东莨菪碱对照品、丁溴东莨菪碱对照品和硫酸阿托品对照品(其他阿扑类化合物)的分离度为指标。经试验，采用0.001 mol*L^-1盐酸-甲醇(185∶340)配制的0.008 mol*L^-1十二烷基硫酸钠溶液为流动相；流速为1.2 mL*min^-1时，氢溴东莨菪碱峰与硫酸阿托品峰分离度为2.1 ；丁溴东莨菪碱峰与硫酸阿托品峰分离度为9.3(见图1)，各峰均能得到完全分离。

图1　加入硫酸阿托品对照品的HPLC图谱
1.溴离子(0.8 min)　2.氢溴酸东莨菪碱对照品(6.1 min)
3.硫酸阿托品对照品(7.0 min)
4.丁溴东莨菪碱对照品(12.1 min)

2.4　空白试验　取用流动相制成的空白溶液，照“有关物质测定法”，进样，结果色谱图上无色谱峰。
2.5　最低检测限　取氢溴酸东莨菪碱对照品，精密称定，用流动相制成每1 mL中约含1.99 μg的溶液，进样10 μL，记录色谱图，以S/N=3∶1计算，最低检出限为19.9 ng。
2.6　回收实验　以测定丁溴东莨菪碱的主要杂质氢溴酸东莨菪碱的回收率进行方法回收考察。精密称取丁溴东莨菪碱、氢溴酸东莨菪碱对照品适量，加流动相制成每1 mL中各含0.1 mg的混合溶液作为供试品溶液，另取氢溴酸东莨菪碱对照品适量，精密称定，加流动相制成每1 mL含0.1 mg的溶液作为对照品溶液，进样，氢溴酸东莨菪碱平均回收率为99.6%(n=5)， RSD为0.55%。
2.7　有关物质测定法　取氢溴酸东莨菪碱对照品适量，精密称定，加流动相制成每1 mL中含0.05 mg的溶液，作为对照品溶液。取本品加流动相制成每1 mL中含2 .5 mg的溶液，作为供试品溶液。量取供试品溶液适量，加流动相稀释成每1 mL中含0.005 mg的溶液，作为预试溶液。取预试溶液10 μL注入液相色谱仪，调整仪器灵敏度，使主成分色谱峰的峰高度为满量程的20%～25%；再取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至供试品溶液主成分峰保留时间的2倍。氢溴酸东莨菪碱按外标法计算，应不得大于0.4%；各杂质峰(除去溶剂附近的溴离子峰)面积的总和应不得大于总峰面积的0.8%。

2.8　样品中有关物质的测定结果　按拟定方法测定丁溴东莨菪碱3批，结果见表1、图2。

表1　3批样品有关物质检查的结果(%)

批号	氢溴酸东莨菪碱	总杂质
971101	0.24	0.24
971102	0.23	0.23
971103	0.24	0.24

图2　丁溴东莨菪碱对照品有关物质的HPLC图谱
1.溴离子(0.8 min)　2.氢溴酸东莨菪碱对照品(6.1 min)
3.丁溴东莨菪碱对照品(12.1 min)

3　讨论

3.1　我们曾用美国Waters公司HPLC仪、484检测器按BP1993年版收载的方法测定，由于测定样品的灵敏度及其规定限度均无法达到，因此重新拟定方法并根据样品测定结果拟定了既符合生产实际，又能控制有害杂质的限度。
3.2　考虑到BP1988年版在本品项下曾对阿扑类化合物进行检查，规定A_{247 nm}/A_{264 nm}<0.94^［5］，故我们加入“硫酸阿托品对照品(阿扑类化合物)”进行试验，在拟定条件下除杂质氢溴酸东莨菪碱能够完全分离外，其他阿扑类化合物也同样能很好分离。
3.3　在空白溶剂中加入溴化钾少许，进样，在溶剂峰附近保留时间为0 .8 min出现色谱峰(见图3)，与文献^［2］记录的情况一致，故计算有关杂质时应扣除溴离子峰。

图3　空白溶剂中加入溴化钾的HPLC图谱
1.溴离子(0.8 min)

王彤彤（成都市药品检验所　成都　610021）
朱蓉（成都市药品检验所　成都　610021）

参考文献
1，中国药典.1995.二部：22
2，BP.1993.344
3，日本药局方.十二改正.496
4，凌大奎.HPLC用于杂质检查的方法学讨论.药典通讯，1997，7(4)：183
5，BP.1988.302

作者： 2007-5-25