出口禽肉中二氯二甲吡啶酚残留量检验方法

本标准规定了出口禽肉中二氯二甲吡啶酚残留量检验的抽样、制样和气相色谱测定方法。
本标准适用于出口鸡肉中二氯二甲吡啶酚残留量的检验。

2 抽样和制样

2.1 检验批
以不超过 2 500箱为一个检验批。
同一检验批的商品应具有相同特征,如包装、标记、产地、规格和等级等。
2.2 抽样数量
批量(箱) 最低抽样数(箱)
1～25 1
26～100 5
101～250 10
251～500 15
501～1000 17
1001～2500 20
2.3 抽样方法
按 2.2 规定的抽样箱数随机抽取,逐箱开启。每箱至少取一袋作为原始样品；原始样品总量不少于 2kg,加封后,标明标记,及时送实验室。
2.4 试样制备
从每袋原始样品中取部分有代表性鸡肉样,用绞肉机绞碎,将全部绞碎的样品混匀；用四分法缩分出试样量不少于 500g,分装入清洁容器内,加封后,标明标记。
2.5 试样保存
试样于－18℃下冷冻保存。
注：在抽样和制样过程中,必须防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。

3 测定方法

3.1 方法提要
用甲醇提取鸡肉组织内的二氯二甲吡啶酚,离心后的上清液经中性氧化铝和阴离子交换柱净化。洗脱液经重氮甲烷试剂甲基化,生成的二氯二甲吡淀甲醚(3,5-二氯-4-甲氧基-2,6-二甲基吡啶)用配有电子俘获检测器的气相色谱仪测定,以 2,4二硝基氯苯为内标进行定量。
3.2 试剂和材料
除特殊规定外,试剂均为分析纯,水为蒸馏水或相应的去离子水。
3.2.1 甲醇
3.2.2 中性氧化铝：层析用,100～200目；300℃灼烧 4h,置于干燥器备用。
3.2.3 阴离子交换树脂：Dowex 1-X8,100～200目,氯型。或等效品。
3.2.4 乙酸甲醇溶液：0.6％(v/v)。3mL冰乙酸溶于 497mL甲醇中。
3.2.5 正已烷：加碱重蒸馏。
3.2.6 内标：2,4-二硝基氯苯,纯度＞99％。
3.2.7 提取用的硝基氯苯正已烷溶液：0.1μg2,4-二硝基氯苯 /mL正已烷溶液。
3.2.8 重氮甲烷试剂:在 125mL 的蒸馏瓶中加入 35mL 乙醇、10mL乙醚和10mL 氢氧化钾水溶液(6g/10mL)。放入磁棒,并固定在磁力搅拌器加热板上的水浴中。连接漏斗和冷凝器并串联两个 125mL锥形瓶,锥形瓶中各置有 10mL乙醚。冷凝收集管插入乙醚液面。锥形接收瓶置于冰浴中。滴液漏斗内盛有 21.5g的 N-甲基-N-亚硝基-p-甲苯磺酰胺溶于 140mL 乙醚的溶液(重氮试剂)。加热水浴至70℃,进行蒸馏,蒸馏瓶内溶液边用磁力搅拌,边滴加重氮试剂,滴完全部溶液的时间控制在20min以上。当馏出液近于无色时,停止蒸馏。将两个锥形接收瓶中的溶液合并,并在 70℃水浴上重蒸馏。将馏出液－重氮甲烷试剂密封,并于－18℃保存。保存期一个月。
3.2.9 二氯二甲吡啶酚标准品：纯度＞99％。
3.2.9.1 二氯二甲吡啶酚标准贮备液：100μg/mL。准确称取100.0mg二氯二甲吡啶酚标准品,用甲醇移入 1 000mL容量瓶至总体积约 600mL,振荡溶解(约需 2～3h)。用甲醇定容到刻度,混匀。
3.2.9.2 中间标准溶液(Ⅰ)：10μg/mL 。用移液管移取上述标准贮备液10mL于100mL容量瓶内,用甲醇稀释至刻度。
3.2.9.3 中间标准溶液(Ⅱ)：1μg/mL 。用移液管移取中间标准溶液(Ⅰ)10mL于100mL容量瓶内,用甲醇稀释至刻度。
3.2.9.4 标准工作溶液： 0.1μg/mL 。用移液管移取中间标准溶液(Ⅱ)10mL于100mL容量瓶内,用甲醇稀释至刻度。

3.3 仪器和设备
3.3.1 搅肉机：电动。
3.3.2 均质机：3000r/min。
3.3.3 离心机：日立 20 PR-520 4 000r/min 或相当的设备。
3.3.4 中性氧化铝柱：称取 2g中性氧化铝(3.2.2),填入 100mm×10mm(内径)玻璃层析柱内。
3.3.5 阴离子交换层析柱：将Dowex 1-X8阴离子交换树脂伴以去离子水移入250mm×10mm(内径)层析柱内,沉降后柱床高度为 1.5cm。以 100mL 1mol/L 的NaOH水溶液淋洗树脂,继以去离子水淋洗至中性；再以 100mL 0.5mol/L 的乙酸钠水溶液淋洗,继以去离子水淋洗至中性。流速均为 2mL/min 。注入甲醇水溶液(8:2)50mL备用。使用前放出甲醇水溶液,使液面略高于树脂层。
3.3.6 试管：带旋盖(耐压并气密性的),100mm×13mm(内径)。
3.3.7 气相色谱仪并配有电子俘获检测器。
3.3.8 微量注射器：10μL。
3.4 测定步骤
3.4.1 提取
称取约20g试样(精确至0.1g)于均质瓶内,加入100mL甲醇,3000r/min均质4min后,将均质瓶移入离心机,4 000r/min离心 10min。
3.4.2 净化
将阴离子交换柱置于中性氧化铝柱下,用移液管移 20mL提取的上清液于氧化铝柱中,使提取液经中性氧化铝和阴离子交换柱流入烧杯。用 10mL甲醇清洗中性氧化铝柱的柱壁。移去氧化铝柱和烧杯,将 25mL的比色管置于阴离子交换柱的下方,用两份 10mL的0.6％乙酸甲醇溶液洗脱二氯二甲吡啶酚,洗提液流速：1mL/min 。用甲醇定容并混匀。
3.4.3 甲基化
用移液管移取定容的洗提液 5mL于试管(3.3.6)内,试管置于 70℃水浴内,通以氮气流吹干。取出试管,加入0.2mL甲醇水溶液(8:2),微温使残渣溶解,冷却至室温。加1mL重氮甲烷试剂,拧上旋盖,将试管置于 70℃水浴中保温反应 2min。反应时,试管内的液面和水浴面持平。取出试管,冷却至室温。拧去旋盖,仅使管底部接触水面,直至乙醚蒸除。
于除去乙醚后的试管内加 5mL去离子水和 1.00mL提取用的硝基氯苯正已烷溶液(3.2.7),加盖,在混和器上混和 1min。取出试管,4 000r/min离心 3min。所制成的上层正已烷样液供气相色谱测定。
3.4.4 测定
3.4.4.1 色谱条件
a. 色谱柱：玻璃柱,2m×2mm(内径),填充物为 10％(m/m)DC-200硅油涂于 Ch-romosorb W HP 载体(80～100目)；
b. 氮气：纯度≥99.99％, 60 mL/min；
c. 柱温：170℃；
d. 进样口温度：200℃；
e. 检测器温度：300℃。
3.4.4.2 色谱测定
将样液(如有必要,可多加提取用的硝基氮苯正已烷溶液,作进一步稀释)注入气相色谱柱,进样量2μL。在上述色谱条件下二氯二甲吡啶甲醚出峰保留时间约为2min,2,4-二硝基氮苯出峰保留时间约为 4min。
3.4.5 标准曲线的绘制
分别取二氯二甲吡啶酚标准工作溶液 0,0.1,0.2,0.4,0.8,1.6mL于各个试管(3.3.6)内,按上述步骤(3.4.3～3.4.4)进行,但略去“定容的洗提液 5mL ”。以所得各浓度二氯二甲吡啶甲醚色谱峰高和内标峰高之比,对应实际标准溶液的浓度(μg/mL) 绘制标准曲线。
3.4.6 回收系数 R
称取三份 19.9～20.1g(精确至 0.1g)不含二氯二甲吡啶酚的试样,分别加入相当于0.0,0.01和 0.05μg/g的二氯二甲吡啶酚中间标准溶液(Ⅱ)(分别为 0.0,0.2和 1mL)。
按 3.4.1～3.4.4条操作,并计算出平均回收系数 R。
3.4.7 空白试验：除不称取试样外,均按上述测定步骤(3.4.1～3.4.4)进行。
3.4.8 结果计算和表述
按下式计算试样中二氯二甲吡啶酚的含量：

      c· V
X＝─────
      R·m

式中： X—鸡肉中二氯二甲吡啶酚含量,mg/kg；
　　　　 R—平均回收率；
　　　　 C—由标准曲线查得最终样液中二氯二甲吡啶酚的含量,μg/mL；
V—最终样液的体积,mL；
m—最终样液所代表的样品量,g；
二氯二甲吡啶酚含量亦可由色谱数据处理机直接求得。
注：计算结果需将空白值扣除。

4 测定低限、回收率

4.1 测定低限
本方法测定低限为 0.005mg/kg 。
4.2 回收率
回收率实验数据：
二氯二甲吡啶酚添加浓度在 0.005～0.025 mg/kg范围内,回收率为 65.4％～86.2％ 。