反相高效液相色谱法测定红细胞中6-巯嘌呤代谢产物的浓度

目的：研究急淋白血病患儿红细胞内6-MP 3种代谢产物的含量情况。方法：应用反相高效液相色谱技术，采用外标法，样品经乙酸苯汞加合物提取，色谱柱为Dupond C₁₈(10 μm，4.6 mm×250 mm)，柱温15 ℃～20 ℃，流动相为甲醇-水(5∶95)，流速0.9 mL^.min^-1，检测波长330和300 nm。结果：红细胞内6-TGN、6-TIMP、6-MeMP的浓度在5～2 000 ng/8×10⁸红细胞范围内线性关系良好，r_s=0.885 5～0.987 1，天内RSD为0.2%～1.2%，天间RSD为1.1%～2.1%。结论：本方法简便、快速、准确，适用于6-MP细胞内药理学研究。
关键词　6-巯嘌呤代谢产物　反相高效液相色谱法

6-巯嘌呤(6-MP)为急淋白血病(ALL)维持治疗的核心药物之一^［1～3］，虽然临床应用广泛，但体内代谢过程复杂而且未完全明确。目前认为在体内最终代谢为具有细胞毒活性的产物，主要为巯嘌呤核苷酸(6-TGN)，然后通过骨髓干细胞掺入DNA发挥抗白血病作用。6-MP首先代谢为次黄嘌呤单核苷酸(6-TIMP)，后者做为6-TGN的底物。形成这种重要活性产物的个体间差异未完全明确，可能与巯嘌呤甲基转移酶(TPMT)活性有关。TPMT为6-MP代谢过程的关键酶，通过甲基化反应形成6-甲基巯嘌呤(6-MeMP)，同时妨碍了6-TGN的形成。而TPMT具有遗传多态性，从而使6-MP活性代谢产物浓度个体间差异很大。
　　文献表明^［4，5］，在ALL维持治疗期间，化疗药物蓄积在红细胞内，且与靶细胞浓度一致；而红细胞内代谢产物浓度在一定时间可达稳定状态，这些均为进行6-MP细胞药理学研究提供了条件。
　　本文参考国外有关文献，建立了反相高效液相色谱分析技术(RP-HPLC)，在同一份标本中同时测定ALL患儿红细胞内6-MP的3种代谢产物：6-TGN，6-TIMP和6-MeMP，以显示给定剂量下其代谢产物浓度的差异；为建立可靠的治疗指数以进行个体化治疗以及判定与复发危险性的关系奠定基础。
1　仪器及试药
　　日本岛津公司生产的LC-4A型高效液相色谱分析仪，配有SPD-2A紫外检测器，CR-3A色谱数据处理。
　　标准品6-MP、6-TG(6-硫鸟嘌呤)、6-TIMP(次黄嘌呤单核苷酸)、6-MeMP(6-甲基巯嘌呤)购自美国Sigma公司。试剂甲醇、甲苯、戊醇、PMA(乙酸苯汞)、DTT(二硫苏糖醇)、三乙胺等购自北京化学试剂商店，均为分析纯。水为双蒸去离子水。
2　实验方法
2.1　对照品储备液的配制　精密称取巯嘌呤对照品各1 mg，加入到10 mL容量瓶中，用0.1 mol^.L^-1 氢氧化钠溶液0.4 mL溶解。除6-TG直接加水至刻度即可外，其它巯嘌呤则用1 mol^.L^-1的盐酸配成浓度为0.1 mol^.L^-1的溶液至刻度。各种储备液浓度均为100 μg^.mL^-1，置4 ℃避光保存。储备液使用前均用含1 mmol^.L^-1 DTT的0.1 mol^.L^-1盐酸溶液稀释。
2.2　PMA加合物的配制　精密称取PMA 43.8 mg、戊醇1.5 g，加入甲苯至100 mL，轻轻振荡1 h，使PMA完全溶解。溶液中PMA和戊醇的浓度分别为1.3 mmol^.L^-1和170 mmol^.L^-1。
2.3　色谱条件及定量方法　采用岛津LC-4A型HPLC；ODS(4.6 mm×250 mm、粒径10 μm)色谱柱，柱温15 ℃～20 ℃，吸收度0.02 AUFS；SPD-2A型紫外检测器；C-R3A型色谱计录仪。流动相甲醇-水(5∶95)，且加三乙胺100 mmol^.L^-1、DTT 0.5 mmol^.L^-1，用磷酸调pH至3.2。流速0.9 mL^.min^-1，波长330和300 nm。由于无合适的图标，故采用外标法，用红细胞标准品求出校正系数，计算样品的浓度，结果见图1。3种化合物在本色谱中可完全分离，A为空白红细胞的色谱行为；B为6-TGN、6-TIMP和6-MeMP对照品在浓度为1.5 pmol^.μL^-1时的色谱分离图；C表示红细胞对照品的色谱分离情况，样品浓度为6-TGN和TIM各3 pmol^.μL^-1和6-MeMP 30 pmol^.μL^-1。3种巯嘌呤的滞留时间为6-TGN 7.8 min、TIMP 9.0 min和6-MeMP 14.0 min。

图1　3种化合物的色谱行为
1.6-TGN　2.6-TIMP　3.6-MeMP

2.4　样本的采集和处理　ALL患儿在服用6-MP第15 d，取前臂肘前静脉血2 mL；用肝素抗凝，在2 h内分离出红细胞(RBC)(1 140 r^.min^-1、4　℃、10 min)，然后用Hank氏液^［6～9］洗脱RBC 2次(1 140 r^.min^-1、4 ℃、10 min和2 280 r^.min^-1、4 ℃、10 min)；加入等倍Hank氏液，进行RBC计数，使其浓度每1 μL约为4×10⁶ 个；置-20 ℃保存待测，患儿红细胞与对照组红细胞同时进行。
2.5　6-MP、6-TG、6-MeMP的提取　精取RBC 200 μL(含8×10⁸ RBC)，加3.75 mmol^.L^-1 DTT 800 μL，1.5 mol^.L^-1硫酸 500 μL，100 ℃加热1 h；冷却后加3.4 mol^.L^-1 氢氧化钠溶液500 μL使溶液 pH达11.6左右，然后加入PMA加合物8 mL，振荡10 min后离心(3 270 r^.min^-1、4 ℃、10 ℃、5 min)；取甲苯液6 mL，加0.1 mol^.L^-1 盐酸 200 μL，涡旋振荡(50 r^.s^-1)20 s×3次，在同条件下离心后，弃去甲苯层。最后留盐酸溶解的残余物200 μL，取50 μL进样。患儿标本与红细胞对照品同时进行抽提。
2.6　线性范围　取对照组红细胞样本7份，1份做空白对照，另6份加6-TG、6-TIMP和6-MeMP各2份，浓度分别为0.03～0.9 nmoL(5～150 ng)，0.03～0.9 nmol(15～450 ng),0.3～30 nmol(0.05～5 ng)/8×10⁸RBC，然后按样品处理及提取法进行分离。由于6-TGN缺乏故以6-TG代替。各浓度分别测定4次，结果见表1。

表1　线性方程、线性范围、相关系数

注：Y=峰高，X=化合物的进样量ng

2.7　萃取回收率　PMA加合物为巯嘌呤抽提的限制因素，在pH为11～12的情况下，用PMA溶液提取红细胞中6-TGN，6-TIMP的回收率分别为73.4%和60.6%；再次抽提回收率分别增加到86.3%和74%；6-MeMP的再次回收率为51.4%。加用校正系数后，个体内天间、天内(RSD)均小于15%。
2.8　精密度试验　进行日内和日间精密度和准确度实验时，选择6-TGN、6-TIMP和6-MeMP的浓度分别为0.6 nmol，0.6 nmol，6 nmol/8×10⁸RBC，按标本处理方法操作，一天内重复测定6次同一浓度的RBC样品，求其RSD；每周测定同一浓度的这3种化合物共5次，求其RSD。天内RSD为0.2%～1.2%，天间RSD为1.1%～2.1%。结果显示天内和天间RSD均小，重复性好。
2.9　样品的测定　31例ALL患儿平均测定次数为4次(3～10次)；测定间隔时间平均为6周(4～18周)。6-TGN：检出率为100%，浓度范围每8×10⁸RBC中为50～692 pmol，平均为187 pmol；6-MeMP：检出率为100%，浓度范围每8×10⁸ RBC中为0.7～29.1 nmol，平均为7.64 nmol，与6-TGN浓度成负相关(图2)，口服相同剂量6-MP(75 mg^.m^-2.d^-1)时，滞留时间在7.8 min和14 min的色谱峰分别为6-TGN和6-MeMP。A为1例6-TGN浓度较低而6-MeMP较高者；B为1例6-TGN浓度较高而6-MeMP偏低者。6-TIMP：检出率为45%，浓度范围每8×10⁸ RBC中为22～128 pmol，平均为30.5 pmol。

图2　色谱行为(2例典型患儿)
1.6-TGN　2.6-MeMP

3　讨论
3.1　流动相对分离的影响　根据巯嘌呤类化合物的极性，并结合文献，选用C₁₈为反相固定相。为使3种组分得到很好的分离，必须选择合适的流动相，根据文献方法，曾选用10%甲醇作为流动相，但6-TIMP和6-TGN的色谱峰部分重叠。在流动相中加入三乙胺做为扫尾剂，这样可使各组分完全分离，而且保留时间与峰对称性适中。实验发现，加入三乙胺后分离物的容量因子随甲醇比例增加而减少，提示三乙胺的加入改变了3种化合物的色谱保留机理。在上述流动相条件下，用磷酸调pH。反复实验，结果表明，pH为3.2时，各组分分离效果最佳，且峰形好。因此，最后选择分离条件为甲醇-水(5∶95)，其中含0.01 mol^.L^-1三乙胺。流动相的温度在15 ℃～20 ℃时，对分离效果影响不大。
3.2　定性方法的可靠性　物质的保留时间只是定性的部分依据，必须考虑到有相同或相近保留时间的物质同时洗脱。我们观察到，一种物质在色谱条件不变，柱效稳定的情况下，不仅其保留时间不变，且峰高度/面积比值衡定。如果此比值变异过大，则可能有杂质峰掺入其中或者是柱效下降，此时，只要再分析标本一次，就可以判断其原因。本方法以保留时间定性，同时通过对照待测峰与标准品的峰高度/面积比值来判断待测峰的纯度，从而提高了物质浓度检测的可靠性。
3.3　质量控制
3.3.1　为保证分析过程中仪器的稳定性，室温控制在15 ℃～20 ℃；开机4～6 h，待基线稳定后进样；实验结束后严格冲洗色谱柱1 h；所有玻璃器皿均用30%硫酸溶液浸泡过夜，双蒸水冲洗。
3.3.2　由于6-MP见光极易分解，储备液应避光保存，故操作过程尽量避光，低温下进行。
3.3.3　每次测定时，用当日2个标准品的色谱行为的平均值与总平均值的均值做为当日测定的标准(峰高、峰面积、滞留时间、峰形)；用3个红细胞标准品的平均值与总平均值的均值求出当日校正系数。
3.4　预处理物的选择　红细胞内巯嘌呤核苷酸在酸性溶液中，加热1 h可完全水解形成嘌呤碱(6-TGN—6-TG；6-TIMP—6-MP)。为保证嘌呤碱在色谱柱中的稳定性，防止经过色谱柱时被氧化水解，在流动相和抽提过程中加入DTT，这样即可防止巯基被氧化，又可避免抽提过程中巯嘌呤被降解；由于汞具有较大的生成螯合物的倾向，其中与硫形成螯合物的能力最强，而且难与含氧组分的有机试剂生成螯合物。因此我们选用乙酸苯汞与甲苯和戊醇形成的加合物对嘌呤碱进行抽提，虽然萃取回收率偏低，但加用校正系数，其结果变异不大。反复实验结果表明，PMA加合物作用的最适pH在11.6。
3.5　波长的选择　嘌呤碱具有强烈的紫外吸收特性，在选择检测波长时，取3种嘌呤碱标准品的酸溶液，进行紫外扫描，其紫外最大吸收波长分别为6-TG 342 nm，6-MP 322 nm，6-MeMP 303 nm。为了便于同时测定，本文选择330 和300 nm为检测波长，我们认为可满足临床需要。
3.6　方法的适用性　本实验建立的RP-HPLC方法，测定ALL患儿红细胞内6-MP 3种代谢产物浓度，具有简便、快速、灵敏的特点。口服标准剂量6-MP的患儿，其红细胞内6-MP 3种代谢产物检出率高，且浓度均在线性范围内。表明该方法作为6-MP细胞内药理学研究和活性产物浓度的检测是可行的，通过调整药量进行剂量个体化，无疑会对ALL患儿的治疗有所裨益。

马晓莉（首都医科大学附属北京儿童医院　北京　100045）
胡亚美（首都医科大学附属北京儿童医院　北京　100045）
吴敏媛（首都医科大学附属北京儿童医院　北京　100045）
崔秀生（首都医科大学附属北京儿童医院　北京　100045）