高效液相色谱法同时检测人血清中全反式及13-顺式维甲酸浓度

目的：建立高效液相色谱方法同时检测人血清中全反式及13-顺式维甲酸浓度。方法：色谱柱：μBondapak C₁₈(3.9 mm×300 mm)，流动相：甲醇-醋酸铵缓冲液(85∶15)，流速：0.8 mL^.min^-1，紫外检测波长：340 nm，柱温：22 ℃，血清样品经乙醚2次提取，按内标法定量，内标物选用对二甲氨基苯甲醛。结果：全反式及13-顺式维甲酸的线性范围分别在0.8～1 120 μg^.L^-1和0.82～1 312 μg^.L^-1，最低检测浓度均为0.6 μg^.L^-1。全反式维甲酸测定的平均回收率为98.86%～105.2%，日内、日间精密度RSD为0.84%～5.5%，13-顺式维甲酸测定的平均回收率为101.6%～101.8%，日内、日间精密度RSD为1.4%～5.7%。结论：本方法灵敏、准确，样品处理简便易行，适用于全反式维甲酸的临床药动学研究。
关键词　全反式维甲酸　13-顺式维甲酸　血药浓度　高效液相色谱法

全反式维甲酸(All-Trans-Retinoic Acid,ATRA)是维生素A的天然氧化代谢产物，在体内经可逆代谢而成13-顺式维甲酸(13-cRA)。ATRA是目前治疗急性早幼白血病(APL)最有效的药物，多数患者用药后病情获得缓解^［1～3］，但在持续用药过程中很快出现耐药，复发几乎普遍发生，其原因可能是ATRA对参与其代谢的酶活性具有自身诱导作用，持续用药导致血药浓度逐步降低^［4］。本文建立了一种灵敏、准确的HPLC法，可同时检测人血清中ATRA及13-cRA浓度，此方法可用于ATRA临床药动学及体内ATRA与13-cRA间的相互转化关系的研究。
1　仪器与试药
　　Waters高效液相色谱仪，包括510型恒流泵，486型可调波长UV检测器，PCM，TCM，Millennium 2010色谱管理系统。XW-80A旋涡混合器(上海医科大学仪器厂)，800型离心沉淀器(上海手术器械十厂)。
　　ATRA及13-cRA对照品(上海第六制药厂提供，含量为99.68%)；对二甲氨基苯甲醛(DMAB，上海试剂三厂)；甲醇为色谱纯，乙醚、醋酸铵，冰醋酸均为分析纯。醋酸铵缓冲液配制：取醋酸铵33.3 g，加水100 mL溶解，加冰醋酸2.3 mL混合，摇匀，即得。
2　色谱条件
　　色谱柱：μBondapak C₁₈(10 μm，3.9 mm×300 mm)；流动相：甲醇-醋酸铵缓冲液(85∶15)；流速：0.8 mL^.min^-1；紫外检测波长：340 nm；柱温：22 ℃；检测灵敏度：0.002 AUFS。
3　样品处理方法
　　取血清样品1 mL，加入内标DMAB 100 ng，用乙醚10 mL分2次提取，每次5 mL，旋涡振荡提取0.5 min，1 500 r^.min^-1离心5 min，合并乙醚提取液至尖底试管中，在40 ℃水浴中用纯N₂吹干，用乙醚0.5 mL淋洗管壁，再用纯N₂吹干，将残渣用甲醇40 μL溶解，取20 μL进样。
4　结果
4.1　色谱行为　在上述色谱条件下，ATRA与13-cRA、内标物及血清内源物质能够实现较好分离，色谱图见图1，ATRA、13-cRA及内标物保留时间分别为8.43，7.65，4.58 min。

图1　ATRA及13-cRA分离色谱图
A.空白血清　B.含药血清
1.ATRA　2.13-cRA　3.内标物

4.2　标准曲线　取空白血清1 mL，分别加入ATRA及(13-cRA)标准甲醇溶液适量精密配成浓度为0.8(0.82)，4(4.1)，16(16.4)，80(82)，160(164)，480(492)，800(820)，1 120(1 312) μg^.L^-1的含药标准血清，按样品处理方法操作，以ATRA，13-cRA与内标物峰面积比A为横坐标，ATRA，13-cRA浓度C为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数。结果表明，ATRA浓度在0.8～1 120 μg^.L^-1范围内有良好线性关系，回归方程为：
C=18.851 6+205.913 8A　r=0.997 7
13-cRA浓度在0.82～1 312 μg^.L^-1范围内有良好线性关系，回归方程为：
C=0.123 9+226.714 6A　r=0.999 1
4.3　回收率　于空白血清中准确加入定量的ATRA及13-cRA标准甲醇溶液，配成低、中、高3种浓度的含药标准血清，按样品处理方法操作，用标准曲线方程测定浓度，以测得浓度与配制浓度的比值计算方法回收率。结果见表1。

表1　ATRA及13-cRA测定的方法回收率(n=3)

4.4　精密度　配制ATRA及13-cRA浓度分别为38.4，128，576，960 μg^.L^-1的含药标准血清各4份，按样品处理方法操作，于同一日内测定，根据测定结果计算日内RSD，另配制ATRA及(13-cRA)浓度分别为43.2(35.2)，108.0(132.0)，540.0(440.0)及972(880)μg^.L^-1的含药标准血清各4份，按样品处理方法操作，于不同日间测定，根据测定结果计算日间RSD。结果日内精密度ATRA为0.84%～3.8%，13-cRA为1.4%～2.5%；日间精密度ATRA为2.3%～5.5%，13-cRA为1.4%～5.7%。
4.5　方法灵敏度　按色谱峰信噪比(S/N)≥3为标准，ATRA及13-cRA直接进样的最低检测量分别为0.20及0.204 8 ng；ATRA及13-cRA的最低检测浓度均为0.6 μg^.L^-1。
5　讨论
5.1　本文建立了一种灵敏、准确的高效液相色谱方法，可同时检测人血清中ATRA及13-cRA浓度。血清样品经乙醚2次提取，可达到较高检测灵敏度。本方法适用于APL病人ATRA血药浓度的常规监测，也适用于研究ATRA的临床药代动力学及ATRA与13-cRA在体内的相互转化关系。通过监测ATRA血药浓度，可以更好地了解在某些APL病人连续用药治疗中临床复发及耐药的原因。
5.2　在本实验中，选定甲醇-醋酸铵缓冲液(85∶15)为流动相，ATRA与13-cRA能获得较好分离，柱温及流速对分离有较大影响，在较低柱温及较小流速情况下ATRA与13-cRA分离较好。
5.3　ATRA及13-cRA对酸、热特别是光敏感，容易出现异构化或氧化降解，在样品测定过程中应特别注意严格控制操作条件，要求在严格避光条件下操作。■

余自成（上海第二医科大学瑞金医院临床药理研究室　上海　200025）
郁人海（上海第二医科大学瑞金医院临床药理研究室　上海　200025）
姚帅（上海中医药大学1999届实习生）

参考文献