反义寡核苷酸中残余硫化剂的测定

      反义寡核苷酸即反义核酸（antisense oligonucleotide），其核苷酸序列可与靶RNA或靶DNA互补，抑制或封闭基因的转录和表达，或诱导RnaseH识别并切割mRNA，使其丧失功能。反义核酸药物是药理学的新领域或新革命［1］，是目前所知最精确、高效及最具广泛意义的调控特异基因表达的潜在策略，它既可以作为研究工具，用于对一些特定蛋白和基因的生理功能的研究，也可作为治疗药物用于癌症、感染性疾病等许多疾病的治疗。然而反义寡核苷酸的功能在很大程度上取决于其稳定性、生物利用度及与靶基因结合特性，通过特定的化学修饰可以改变这些物理化学特性，从而增加抗病毒、抗肿瘤和其他特定基因的表达抑制活性。以硫代磷酸酯为骨架修饰的硫代寡核苷酸（磷酸二酯骨架中的非桥氧原子被硫取代）是最广泛研究的反义核酸，现在进入临床的所有ODN几乎都是PS-ODN［2］，它具有抗核酸酶水解、良好的亲核性、方便的同位素标记等特点。

      常见的硫代修饰剂有Beaucage试剂（3H-1,2-Benzodithiol-3-one-1,1-dioxide,简称B）和二硫化四乙基秋兰姆（Tetraethylthiuram disulfide,简称T）等，结构式见图1。然而反义核酸中残余的硫化剂对反义药物本身有副作用，对生物体也有一定毒性。因此，在反义寡核苷酸药物的质量控制中需要确定它们的残余量。
1 实验部分
1．1仪器与试剂
      HP 5890气相色谱仪，配FID检测器，HP 3394自动积分仪，HP 5971高性能台式气相色谱-质谱联用仪，配有WILLY138谱库，ZabSpec高分辨磁质谱仪，PE 235高效液相色谱仪。
      标准品B和T购自Sigma公司(纯度均大于99%)，巯基乙醇为Fluka公司，其它试剂均为色谱纯。
1．2分析条件
      气相色谱条件：HP-1非极性柱(30mγTM0.52mmγTM 0.32 μm)；柱温采用程序升温：初温150℃，保持3分钟，以10℃/分钟升温至250℃，保持10分钟；进样器温度250℃；检测器温度270；载气为高纯氮，流速1.2mL/min；分流比15：1；分流进样，进样量体积为1.0μL。
      气相色谱-质谱条件：HP-5TA柱(30mγTM0.25mmγTM 0.25 μm)；柱温采用程序升温：初温80℃，以15℃/分钟升温至250℃，保持10分钟；进样器温度250℃；检测器温度280℃；载气为高纯氦（纯度>99.999%），流速32cm/min；柱头压11.5psi；分流进样，进样量1.0μL电离方式为电子轰击（EI），接口温度170℃，传输线温度250℃，电子能量70eV，电子倍增器电压1.3eV，溶剂延迟3分钟。
      高效液相色谱条件：反相色谱柱（250mmγTM4.6mm，BIO-RAD公司），流动相为V（甲醇）：V（水）=70：30的溶液，流速1.0mL/min；检测波长220nm；柱温45℃，进样量50μL。
1．3标准溶液的配制
      精密称取<SPAN lang=EN-US>11.0mg的B置于10mL容量瓶中，用苯定容，配制成1.10mg/mL的标准储备液，逐级稀释至所需要的浓度。同样，将T配制成1.17mg/mL的标准储备液。
1．4化学衍生化
      取0.5mL的标准储备液，加入0.5μM的NH4HCO3缓冲液再加入浓度为1.114g/mL的巯基乙醇10μL，在55℃水浴中反应。每隔一小时采样150μL，立刻冷却至-20℃保存，总共采样6次。将得到的样品经反相HPLC和磁质谱检测。结果表明反应4h时，衍生化进行完全，并且试药与巯基乙醇的质量分数比为2：1时，衍生化效果最佳。
2 结果与讨论
2.1 气相色谱条件的优化
2.1.1 溶剂的选择
      分别用二硫化碳、三氯化碳、丙酮、二氯化碳、四氢呋喃、乙腈和苯作溶剂，样品在上述溶剂中都有良好的溶解性，但除乙腈和苯之外，在气相色谱图上都有溶剂脱尾现象和溶剂对进样针的浸润作用，故考察选用乙腈和苯作溶剂。又从峰形和测定重复性方面考察，苯比乙腈的使用效果好，因此，实验中选用苯作溶剂。
2.1.2 色谱柱的选择
     选用极性柱HP- INNOWax、中极性柱BP-225和非极性柱HP-1三种气相色谱柱进行实验，均可进行检测。但使用前二种色谱柱，色谱峰拖尾比较严重，因此会影响分析方法的精密度和线形范围。使用后一种色谱柱HP-1能够克服这一不足。
2.1.3 柱温的选择
      考察了恒温和程序升温二种情况，在分离度和最低检测限量方面，程序升温好于恒温，并经反复实验比较不同升温方式，确立最佳升温程序。同时，在选择初始柱温时，既要考虑能缩短分析周期，又要考虑被检测物的灵敏度。当该温度在100℃~150℃时，单位进样量的峰高基本不变，但当该值大于150℃时，色谱峰明显拓宽，峰高度显著降低。因此，初始柱温选择150℃比较合适。
202 气相色谱-质谱的测定
      将B和T的衍生化样品分别进行GC/MS全扫描分析，质谱图见图2和图3。由图2、图3可知，B和T的基峰分别为168和116。分别以m/z 168, m/z 116的离子作为特征目标监测离子，同时以保留时间及WILEY138谱库的检索结果对样品做进一步确证，确保结果准确可靠。
2.3 检出限与线性范围
      B和T标准品的色谱图见图4和图5。为了确定它们的最低检测限量和线性范围，对不同浓度的标准溶液进行分析，得到了不同进样量的色谱峰面积及峰高。以色谱峰高度是基线噪声高度的2倍作为标准计算最低检测限量，则B的最低检测限量为50mg/mL,T的最低检测限量为100mg/mL。
两种硫化剂的线性回归方程如下：
B：Y=14228X-248846,r=0.995；
T: Y=13158X-343695,r=0.998
其中X为进样量，Y为色谱峰面积，线性范围：150mg/mL-1100mg/mL。
3.结语
     反义寡核苷酸是一类新型药物，有关研究历史不长，特别是还未建立系统的药物质量控制标准与检验方法标准。测定反义寡核苷酸中残余硫化剂，由于课题工作量大，多步骤展开研究，因此，研究时间紧张。本课题研究了二类最常用硫化剂，尚有其它硫化剂未涉及，还有待继续研究。