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摘要：MARS(Multi-adsorption Reverse SPE) 样品前处理方法是一种快速、简便、安全、成本低廉的样品前处理分析方法，将该方法用于奶制品、鸡蛋和鱼肉等不同样本中的三聚氰胺的提取，主要步骤是使用0.1M的盐酸、6%的磺基水杨酸和混合型阴离子交换树脂（Cleanert PAX）在离心管中同时进行蛋白沉淀和基质分散固相萃取，取离心上清液过滤后用于HPLC测定。本文对MARS方法用于不同样品前处理的稳定性和可靠性进行了分析和评价，结果表明MARS-HPLC方法用于不同样品中三聚氰胺的检测具有简便、快捷、准确的优点，适合大批量样品的测定。
关键词：三聚氰胺；MARS；混合型阴离子交换树脂；强阳离子交换色谱柱
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
仪器：L6-1 系列高效液相色谱仪（北京普析通用公司），三聚氰胺检测样品前处理方法包：（包括盐酸0.1 mol/L，6% 磺基水杨酸，混合型阴离子交换填料Cleanert PAX，（北京艾杰尔科技有限公司）；Venusil SCX-M，5μm,4.6×250mm 强阳离子交换色谱柱（科技部“十一五”国家支撑计划成果，北京艾杰尔科技有限公司）及保护柱；针式过滤器（Agela Clarify，0.22/0.45µm，尼龙）；三聚氰胺标准品（>99%），均质器（T25 Basic，IKA）。
试剂：所用乙腈为色谱纯；磷酸二氢钾为分析纯；水为超纯水。
1.2 色谱条件
色谱柱：Venusil SCX-M色谱柱，4.6×250mm,5μm,300 Å；（科技部“十一五”国家支撑计划成果，北京艾杰尔科技有限公司）；流动相：磷酸二氢钾（0.050mol/L）：乙腈=70：30；流速：1.5mL/min；柱温：室温；波长：240 nm；实验中若非特别注明，进样量均为20μL。
1.3 三聚氰胺标准曲线工作液的配制
1.3.1 三聚氰胺标准贮备溶液：1.00×103 mg/L。
称取100 mg 三聚氰胺标准物质（准确至0.1 mg），用水完全溶解后，用水定容至100 mL，混匀。
1.3.2 标准工作溶液
1.3.2.1 标准溶液A：2.00 ×102 mg/L。
准确移取20.0 mL 三聚氰胺标准贮备溶液（1.3.1），置于100 mL 容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀，待用。
1.3.2.2 标准溶液B：0.50 mg/L。
准确移取0.25 mL 标准溶液A（1.3.2.1），置于100 mL 容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀，待用。
1.3.2.3 标准工作液的配制
按表1 分别移取不同体积的标准溶液A（1.3.2.1）于容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀，0.45μm滤膜过滤，待测。按表2分别移取不同体积的标准溶液B（1.3.2.2）于容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀，0.45μm滤膜过滤，待测。
表1 标准工作液配制（高浓度）
|
标准溶液A体积(mL) |
0.1 |
0.25 |
1.00 |
1.25 |
5.00 |
12.5 |
|
定容体积(mL) |
100 |
100 |
100 |
50 |
50 |
50 |
|
标准工作液浓度(mg/L) |
0.20 |
0.50 |
2.00 |
5.00 |
20.0 |
50.0 |
表2 标准工作液配制（低浓度）
|
标准溶液B体积(mL) |
1.00 |
2.00 |
4.00 |
20.0 |
40.0 |
|
定容体积(mL) |
100 |
100 |
100 |
100 |
100 |
|
标准工作液浓度(mg/L) |
0.005 |
0.01 |
0.02 |
0.10 |
0.20 |
1.4 试样的制备
1.4.1 牛奶样品
取15.0g牛奶置于25mL容量瓶中，加入0.1mol/L 盐酸10mL，加入6% 磺基水杨酸3.0 mL， 混合型阴离子交换树脂1.0g（Cleanert PAX），用0.1mol/L 盐酸定容至25mL，涡旋振荡2min，8000 r/min离心5min，取上清液过0.45μm的滤膜后进液相分析。
1.4.3 鸡蛋样品
取10.0g混合均匀的鸡蛋置于25mL容量瓶中，加入0.1mol/L 盐酸10mL，均质后全部转入25mL容量瓶，加入6% 磺基水杨酸3.0mL，混合型阴离子交换树脂1.0g（Cleanert PAX），用0.1mol/L 盐酸定容至25mL，涡旋振荡2min，8000 r/min离心5min，取上清液过0.45μm的滤膜后进液相分析。
1.4.4 鱼肉样品
取5.0g剁碎的鱼脊背肉，加入0.1mol/L 盐酸10mL，均质后全部转入25mL容量瓶，加入6% 磺基水杨酸3.0 mL，混合型阴离子交换树脂1.0g（Cleanert PAX），用0.1mol/L 盐酸定容至25mL，涡旋振荡2min，8000 r/min离心5min，取上清液过0.45μm的滤膜后进液相分析。
2、结果与讨论
2.1 线性范围
低浓度曲线取0.005mg/L, 0.01mg/L, 0.02mg/L, 0.1mg/L, 0.2mg/L 5个浓度的标准样品测试，所得标准曲线如下图：
高浓度曲线取0.2mg/L, 0.5mg/L, 2mg/L, 5mg/L, 20mg/L, 50mg/L 6个浓度的标准样品测试，所得标准曲线如下图：
结果表明：本方法在0.005mg/L~ 50.0mg/L和范围内，三聚氰胺峰面积和浓度有良好的线性关系
2.2 重复性
取浓度为5mg/L的标准品溶液，分别进样20μL，进样6次，计算保留时间及峰面积的RSD（相对标准偏差）。结果列于表3中
表3 保留时间和峰面积的重现性（精密度）
|
1# |
2# |
3# |
4# |
5# |
6# |
平均值 |
RSD% | |
|
保留时间min |
6.817 |
6.833 |
6.817 |
6.817 |
6.858 |
6.808 |
6.825 |
0.26 |
|
峰面积 μAu·s |
571360 |
574492 |
569813 |
572187 |
574525 |
575593 |
572995 |
0.39 |
从表3和图3看出，该方法结果重复性良好。
2.3 检出限
以曲线最低点0.005mg/L的谱图（见图4）为准，以噪声对应峰高估算检出限为0.0032mg/L (S/N=3)。
2.4 实际样品测试
2.4.1 牛奶样品
2.4.1.1空白牛奶样品测试谱图如图5：
2.4.1.2 牛奶加标回收率
分别在空白牛奶样品中加入相当于1.0mg/Kg，5.0mg/ Kg和10.0mg/ Kg的三聚氰胺标准品，测试谱图如图6所示。
根据此谱图测得三聚氰胺的加标回收率如表4所示
表4 牛奶中三聚氰胺加标回收率试验结果
|
样品名称 |
加标量（mg/Kg） |
测得量（mg/ Kg） |
回收率（%） |
|
牛奶空白 |
0.00 |
- |
- |
|
1# |
1.00 |
1.05 |
105.0% |
|
2# |
5.00 |
5.18 |
103.6% |
|
3# |
10.00 |
9.04 |
90.4% |
结果表明，MARS前处理方法对牛奶中三聚氰胺提取具有良好的回收率，杂质去除效果好；HPLC分析中三聚氰胺和杂质分离良好。
2.4.2 鱼肉样品
2.4.2.1 空白鱼肉样品测试谱图如图7：
2.4.2.2 鱼肉样品加标回收率
分别在空白鱼肉样品中加入相当于1.0mg/kg、5.0mg/kg和10.0mg/kg的三聚氰胺标准品，测试谱图如图8和图9所示。
根据此谱图测得鱼肉中三聚氰胺加标回收率如表4所示
表5 鱼肉中三聚氰胺样品加标回收率试验结果
|
样品名称 |
加标量（mg/kg） |
测得量（mg/kg） |
回收率（%） |
|
鱼肉空白 |
0.00 |
- |
- |
|
1# |
1 |
0.98 |
98.0% |
|
3# |
5 |
5.81 |
116.2% |
|
5# |
10 |
9.67 |
96.7% |
结果表明，MARS前处理方法对鱼肉中三聚氰胺提取具有良好的回收率，杂质去除效果好；HPLC分析中三聚氰胺和杂质分离良好。
2.4.3 鸡蛋
2.4.3.1空白鸡蛋样品测试谱图如图10所示：
2.4.1.2 鸡蛋加标回收率
分别在样品中加入相当于1.0mg/Kg，5.0mg/ Kg和10.0mg/ Kg的三聚氰胺标准品，测试谱图如图11所示。
鸡蛋中三聚氰胺的加标回收率如表6所示
表6 鸡蛋中三聚氰胺加标回收率试验结果
|
样品名称 |
加标量（mg/kg） |
测得量（mg/kg） |
回收率（%） |
|
鸡蛋空白 |
0.00 |
- |
- |
|
1# |
1 |
0.89 |
89.0% |
|
3# |
5 |
5.55 |
111.0% |
|
5# |
10 |
10.48 |
104.8% |
结果表明，MARS前处理方法对鸡蛋中三聚氰胺提取具有良好的回收率，杂质去除效果好；HPLC分析中三聚氰胺和杂质分离良好。
3 结论
上述实验结果表明，采用MARS样品前处理方法，以混合型阴离子交换填料Cleanert PAX作为萃取介质，可以快速准确的处理牛奶、鱼肉和鸡蛋样本，同时使用阳离子交换色谱柱进行HPLC分析，整个分析方法应用于不同样品中三聚氰胺的检测，具有检测限低，精密度高，线性范围宽和回收率高等优点，完全可以满足三聚氰胺的快速检测要求。