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1范围
本标准规定了用酶抑制法测定蔬菜中有机磷农药及氨基甲酸酯农药残留的简易检验方法。
本标准适用于蔬菜中有机磷农药及氨基甲酸酯农药残留的测定。
2原理
有机磷农药及氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶的活性有抑制作用，在一定条件下，其抑制率取决于农药种类及其含量。
在pH7～8的溶液中，碘化硫代乙酰胆碱被胆碱酯酶水解，生成硫代胆碱。硫代胆碱具有还原性，能使蓝色的2，6?二氯靛酚褪色，褪色程度与胆碱酯酶活性正相关，可在600nm比色测定，酶活性愈高时，吸光度值愈低。当样品提取液中有一定量的有机磷农药或氨基甲酸酯类农药存在时，酶活性受到抑制，吸光度值则较高。据此，可判断样品中有机磷农药或氨基甲酸酯类农药的残留情况。样品提取液用氧化剂氧化，可提高某些有机磷农药的抑制率，因而可提高其测定灵敏度，过量的氧化剂再用还原剂还原，以免干扰测定。
3试剂或材料
3．1底物溶液：2％碘化硫代乙酰胆碱水溶液，1g碘化硫代乙酰胆碱，加缓冲液溶解并定容至50mL。
3．2缓冲液：，
pH7．71磷酸盐缓冲液：
A液：1／15mol／L磷酸氢二钠溶液：称取磷酸氢二钠(Na2HP04?12H20)2．3876g加水定容至100mL。
B液1／15mol／L磷酸二氢钾溶液：称取磷酸二氢钾0．9078g加水定容至100mL。
取A液90mL、B液10mL混合，即得pH7．71磷酸盐缓冲液。
3．3显色剂：0．04％2，6?二氯靛酚水溶液。
3．4氧化剂：0．5％次氯酸钙水溶液。
3．5还原剂：10％亚硝酸钠水溶液。
3．6胆碱酯酶液，0．2g酶粉(其制备方法见附录A)加10mL缓冲液溶解。
3．7脱色剂：活性炭。
3．8丙酮：分析纯。
3．9碳酸钙：分析纯。
4装置
4．1分光光度计。
5分析步骤
以下操作可在15℃～30C温度下进行。
5．1试样的制备
蔬菜样品擦去表面泥水，取代表性食部，剪碎，取2g置于10mL烧杯中，加5mL丙酮浸泡5min，不时振摇，加0．2g碳酸钙(对于番茄等酸性较强的样品可加0．3～0．4g)。若颜色较深，可加o．2g活性炭，摇匀，过滤。
5．2氧化
取0．5mL丙酮滤液于5mL烧杯中，吹干丙酮后，加0.3mL缓冲液溶解。加入氧化剂0．1mL，摇匀后放置10min。再加入还原剂0.3mL，摇匀。
5．3酶解
加入酶液0．2mL，摇匀，放置10min，再加入底物溶液0.1mL，放置5min后测定。
5．4测定
分光光度计波长调至600nm，其他按常规操作，读取测定值。
6结果的表述
6．1测定结果的，
当测定值在0.7以下时，为未检出。
当测定值在0.7~0.9之间时，为可能检出，但残留量很低。
当测定值为0.9以上时，为检出。
测定值与农药残留量正相关，测定值越高时，说明农药残留量越高。
6．2方法最低检
本方法最低检出浓度间表1。
附录A
(规范性附录)
胆碱酯酶粉的制备
A．1试剂
A．1．10．1mol／LpH6．0磷酸缓冲液
0．1mol儿磷酸氢二钠溶液：17．56g磷酸氢二钠(Na2HP04?2H20)溶于1000mL水。
0．1mol儿磷酸二氢钠溶液：13．80g磷酸二氢钠(NaHzPO4?2H20)溶于1000mL水。
将12．3mL0．1mol儿磷酸氢二钠溶液与87．7mL0．1mol儿磷酸二氢钠溶液混合，即为0．1mol／LpH6．0磷酸缓冲液。
A．1．20．005mol／LpH6．0磷酸缓冲液
取50mL0．1mol／LpH6．0磷酸缓冲液(A．1．1)液加水稀释至1000mL。
A．1．30．5mol儿氢氧化钠－0．5mol／L氯化钠溶液
1．0mol／L氢氧化钠溶液：取40g氢氧化钠溶于1000mL水中。
1．0mol／L氯化钠溶液：取58．5g氯化钠溶于1000mL水中。
将上两液1：1混合，即得0．5mol儿氢氧化钠?0．5mol／L氯化钠溶液。
A．1．40．5mol／L盐酸?0．5mol／L氯化钠溶液
1．0mol／L盐酸溶液：取83．33mL浓盐酸溶于1000mL水中。
将1．0mol儿盐酸溶液与1．0mol儿氯化钠溶液1：l混合，即得0．5mol儿盐酸－0．5mol／L氯化钠溶液。
A．1．5羧甲基纤维素(CM?纤维素)干粉
A．2装置
A．2．1梯度混合器：两瓶连通式，每瓶容量200mL。
A．2．2柱层析系统：1．5x40cm玻璃层析柱，流量可达2mL／min蠕动泵。
A．2．3冷冻干燥机。
A．3程序
A．3．1羧甲基纤维素的处理
取10g羧甲基纤维素(CM?纤维素)干粉置于烧杯中，加入100mL0．5mol儿氢氧化钠－0．5mol／L氯化钠溶液，混匀，静置15min后，用布氏漏斗抽滤，水洗滤饼至中性。将此滤饼再悬浮于100mL1mol儿盐酸溶液中，混匀，静置10min后再用布氏漏斗抽滤，水洗滤饼至中性。再将滤饼悬浮于100mi。0．5mol／L盐酸－0．5mol／L氯化钠溶液中，混匀，静置15min后用布氏漏斗抽滤，水洗滤饼至中性。将滤饼悬浮于0．005mol儿pH6．0磷酸缓冲液(A．1．2)中。
A．3．2胆碱酯酶的提取
取50g新鲜食用面粉置三角瓶中，加250mL蒸馏水，振荡30min。
静置30min以上，取上清液经5000r／min离心20min。
收集上清液用冷冻干燥机浓缩至20mL左右，为胆碱酯酶粗提掖，保存于冰箱中待纯化。
A．3．3胆碱酯酶粗提掖的纯化
将处理好的羧甲基纤维素悬浮液加入层析柱中，加150mL0．005mol／LpH6．0磷酸缓冲液(A．1．2)于梯度混合器的初始液瓶中，加150mL0．1mol／LpH6．0磷酸缓冲液(A．1．1)于梯度混合器的高浓度液瓶中。连接柱层析装置，以2mL／min流速做梯度洗脱，收集后1／2流出液。
A．3．4冷冻干燥
将A．3．3中的流出液用冷冻干燥机干燥成千粉，以0．2g／瓶封装于安瓿瓶中备用。置4℃冰箱中可保存1年有效。