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【关键词】 苯霜灵,对映体,残留,高效液相色谱
摘要 以高效液相色谱手性固定相法在对映体水平上建立了苯霜灵的分析方法。采用OD手性色谱柱，正己烷/异丙醇流动相，流速为1.0 mＬ/min，检测波长206 nm，以圆二色检测器对两对映体进行出峰顺序确证并考察了其圆二色特性。结果显示，苯霜灵单一对映体在0.52~259.2 mg/L浓度范围内具有较好的线性，线性相关系数均大于0.9994，最低检出限为0.26 mg/L，在240 nm处的出峰顺序为（+）/（-）。同时建立了苯霜灵对映体在土壤、水、葡萄中的残留分析方法。土壤和葡萄样品分别用丙酮和乙腈提取，水样用固相萃取法（SPE）富集净化。土壤中两对映体在0.025~2.5 mg/kg范围内的回收率为93.67％~108.95％之间；水样品在0.005~0.5 mg/L浓度范围的回收率在85.13％~100.79%之间，葡萄样品在0.04~1 mg/kg浓度范围的回收率在83.22％~106.62％之间；相对标准偏差RSD均小于6％。
关键词 苯霜灵，对映体，残留,高效液相色谱
1 引言
N苯乙酰基N2,6二甲苯基DL丙氨酸甲酯（苯霜灵，benalaxyl）是内吸性杀菌剂，用于防治葡萄的单轴霉菌，马铃薯、草莓、番茄的晚疫菌，烟草、洋葱、大豆的霜霉菌，黄瓜的假霜霉菌等。分子中含有一个手性碳原子，具有一对对映异构体。目前苯霜灵仍以外消旋体的形式生产和使用，未见有单一对映体的相关研究。
苯霜灵的残留分析方法在国内未见有报道，国外的相关研究也较少，Gambacorta等［１］曾用气相色谱检测了西红柿中的苯霜灵残留，样品用丙酮和二氯甲烷提取；Patakioutas等［２］同样用气相色谱法分析了土豆田土壤和水中的苯霜灵，水样用正己烷萃取，土壤样品则以丙酮提取；Navarro等［３］也曾用气相色谱检测过苯霜灵在葡萄中的残留。苯霜灵对映体在环境样本中的残留分析至今未见报道。
本实验使用高效液相色谱法实现了苯霜灵对映体的拆分，建立了分析方法，并对方法的有效性进行了验证。另外对残留于土壤、水、葡萄样本中微量的苯霜灵进行了残留分析，建立了提取、净化、检测方法。相关研究可为苯霜灵单一异构体的研究如杀菌活性、毒性毒理、代谢、环境残留等奠定基础。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
Agilent 1100高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）;DAD检测器;HP Chemstation数据处理系统；JASCO 2000高效液相色谱仪(日本分光株式会社）;UV2075紫外检测器和CD2095圆二色检测器，Chrompass工作站。
C18固相萃取小柱（Supelco, 500 mg/3 mL）,色谱柱250 mm×4.6 mm (i.d.)，填充纤维素三（3,5二甲基苯基氨基甲酸酯）涂敷氨丙基硅胶手性固定相（OD）,自制[4，5]。苯霜灵原药，纯度98％（农业部农药检定所）；正己烷、异丙醇、丙酮、二氯甲烷、乙腈、甲醇、无水硫酸钠、ＮaCl均为分析纯（北京益利精细化学品公司）。正己烷和异丙醇流动相用前需重蒸，过0.45 μm滤膜。
2.2 土壤、水、葡萄样本的制备
称取阴干土壤25 g，置于250 mL锥形瓶中，加入10 mL去离子水。加入一定体积苯霜灵溶液（异丙醇溶剂），振荡平衡1 h，加入50 mL丙酮，0.02 g活性碳，振荡1 h，静置，将上层溶液抽滤，剩余残渣用20 mL×2丙酮再次提取，合并提取液，40℃旋转蒸发，剩余溶液转移至分液漏斗，加入5 mL饱和NaCl溶液，用30、20和15 mL二氯甲烷提取3次，合并提取液，旋转蒸发近干，氮气吹干后用异丙醇定容1 mL，待测定。
自来水100 mL，加入一定体积苯霜灵溶液，摇匀，静置1 h。
C18固相萃取小柱先后用5 mL超纯水、5 mL甲醇、5 mL超纯水活化，水样以约1 mL/min流速过柱，以10 mL超纯水洗涤，真空抽干0.5 h。用5 mL无水甲醇洗脱，收集洗脱液，35℃氮气吹干，异丙醇定容1 mL。
称取捣碎葡萄样本25 g于250 mL锥形瓶中，加入苯霜灵溶液后振荡平衡1 h，加入40 mL乙腈，振荡1 h，抽滤上清液，残渣用乙腈20 mL×2提取，合并提取液，40℃减压浓缩，剩余液体转移至250 mL分液漏斗中，加入5 mL饱和NaCl溶液，用30、20和15 mL二氯甲烷萃取，经无水硫酸钠干燥，减压浓缩近干，异丙醇定容1 mL，待测。
2.3 色谱条件
流动相：正己烷/异丙醇85/15，流速为1.0 mL/min;紫外检测波长206 nm（最大吸收波长）;温度:室温;进样体积20 μL，本实验涉及如下参数：容量因子(k′=(t-t0)/t0); 分离因子 (α= k′1/k′2) ，分离度(Rs=2(t2-t1)/(w1+w2))； t0为死时间；t为保留时间，k′1和k′2分别为先后洗脱对映体的容量因子，w为基线峰宽。
3 结果与讨论
3.1 对映体的分离及出峰顺序
在正己烷/异丙醇体系内对苯霜灵对映体进行了拆分，考察了异丙醇含量对拆分的影响。苯霜灵两对映体在OD手性柱上具有较好的选择性，在所考察的异丙醇体积含量范围（20％～2％）内都可以达到基线分离，表1列举了相关数据。随着异丙醇含量的减少分离度增加，但分析时间大大延长。综合考虑到环境样本中杂质的干扰、分析时间等因素，选择正己烷/异丙醇＝85/15为流动相。图1为苯霜灵对映体的拆分色谱图。
图1 苯霜灵对映体的拆分色谱图（略）
流动相（molbile phase）: 正己烷/异丙醇（nhexane/isopropanol）： 85/15； 1.0 mL/min； λ＝206 nm。
表1 苯霜灵对映体在正己烷/异丙醇体系内的手性拆分（略）
使用JASCO高效液相色谱圆二色检测器对出峰对映体进行了圆二色谱在线扫描，如图2所示。纵坐标为圆二色响应和吸收强度，横坐标为波长，两对映体的圆二色吸收曲线以“0”刻度线对称，“0”刻度线以下负值表示对映体为（-）CD信号，正值则表示（+）CD信号。圆二色谱图显示了连续波长下对映体的圆二色响应情况。在220～230 nm范围内，先流出对映体为（-），后流出对映体则为（+）。而230～260 nm之间两对映体的CD信号发生转向， 最大圆二色吸收波长为240 nm，该处的出峰顺序为+/-。本实验中所提到的出峰顺序（+/-）均为圆二色最大吸收波长240 nm下的CD信号。
3.2 方法的有效性验证
3.2.1线性 配制一系列浓度苯霜灵标准溶液，重复进样，考察方法的有效性。准确称取苯霜灵样品，用异丙醇溶解，配制成259.2、129.6、64.8、5.2和0.52 mg/L（单一对映体浓度）５个浓度的标准溶液，在正己烷∶异丙醇85∶15流动相条件下分别进样20 μL，每个浓度平行3次（n=3），检测波长206 nm，按照浓度峰面积绘制标准曲线。结果显示，在单一对映体浓度为0.52～259.2 mg/L范围内具有较好的线性关系，(+)对映体（先流出）的线性回归方程分别为y=65.53x+119.44，相关系数R为1；(-)对映体（后流出）的线性回归方程分别为y=61.57x+240.41，相关系数R为0.9994。图3为两对映体的线性回归曲线。
图2 苯霜灵对映体的圆二色光谱图（略）
Fig.2 Circular dichroism (CD) spectra for the two enantiomers of benalaxyl
实线为先流出对映体，虚线为后流出对映体(continuous line and imaginal line represent the first and second eluted enantiomers respectively)。
图3 苯霜灵两对映体的线性回归曲线（略）
1. 对映体（+）（enantiomer (+)）; 2. 对映体（-）（enantiomer (-)）。
3.2.2 灵敏度和精密度 苯霜灵的检出限为0.26 mg/L，表2列出了两对映体相关参数的精密度数据。如表２所示，保留时间、容量因子、分离因子都具有非常好的精密度（相对标准偏差RSD<0.7%），而峰面积和分离度的相对标准偏差在低浓度时相对偏大（RSD<4.0%），精密度数据显示，实验方法具有较好的稳定性。
表2 分析方法的精密度（略）
上标1和2分别表示先、后流出的对映体（the marks １, 2 denote the 1st and 2nd elute of enantiomer, respectively）。
3.3 环境样本中苯霜灵的残留分析
土壤样品回收率和精密度实验设了0.025、0.25和2.50 mg/kg ３个浓度，重复3次，结果列于表3。由表３可以看出，３个浓度两对映体的回收率在93.67％~108.95％之间；相对标准偏差RSD<6％。低浓度0.025的回收率偏高。以丙酮进行提取时，土壤中的色素也被提取出来，在提取过程中加入少量活性碳可有效吸附色素。
表3 土壤中苯霜灵的添加回收实验（略）
对水样品使用SPE法进行苯霜灵的富集净化，共设0.005、0.05、0.125和0.5 mg/L ４个浓度。由表4可以看出，使用C18固相萃取填料可有效提取水中的苯霜灵，杂质干扰少，４个浓度的回收率均在8513％~100.79％之间；相对标准偏差RSD<5％。
表4 水中苯霜灵的添加回收实验（略）
由于葡萄样品中的干扰杂质较多，对多种提取溶剂进行了比较，最终选择乙腈进行提取。乙腈可有效提取样本中的苯霜灵，但提取的色素及其它杂质成分少，不需净化。表5显示，0.04、0.2和1 mg/kg ３个浓度的回收率在83.22％~106.62％之间；相对标准偏差RSD<6％。图4为土壤、水、葡萄样本中最小添加浓度的苯霜灵色谱图。
表5 葡萄中苯霜灵的添加回收实验（略）
图4 苯霜灵在样本中的残留色谱图（略）
a. 土壤（soil）： 0.025 mg/kg； b. 水（water）： 0.005 mg/L； c. 葡萄（grape） 0.04 mg/kg。
4 结论
在对映体水平上建立了苯霜灵的常量及残留分析方法，可有效检测苯霜灵的光学纯度及环境样本中的残留，方法相对简单。所使用的残留提取方法可得到较好的回收率，在提取水样本时使用了SPE法，避免了大量有机溶剂的使用。乙腈提取葡萄样本的杂质少，减少了检测过程中的干扰。本实验可为研究苯霜灵单一异构体的毒性毒理、代谢、残留、降解等奠定基础。
References
1 Gambacorta G, Faccia M, Lamacchia C, di Luccia A, la Notte E. Food Control, 2005, 16: 629~632
2 Patakioutas G I, Karras G, Hela D, Albanis T A. Pest. Manag. Sci.， 2002, 58: 1194~1204
3 Navarro S, Barba A, Navarro G, Vela N, Oliva J. J. Chromatogr. A, 2000, 882: 221~229
4 Wang P, Jiang S R, Liu D H， Wang P, Zhou Z Q. J. Biochem. Biophy. Meth., 2005, 62 (3): 219~230
5 Wang Peng(王 鹏), Jiang Shuren(江树人), Zhang Hongjun(张宏军), Zhou Zhiqiang(周志强)． Chinese J. Anal. Chem. (分析化学), 2004, 32（5）: 625~627
本文系国家自然科学基金资助项目（No.20377052）
（中国农业大学应用化学系，北京 100094）
（农业部农药检定所，北京 100026）