HPLC法测定大黄 虫胶囊中大黄酸的含量

    摘要用高效液相色谱法对大黄虫胶囊中大黄酸进行了含量测定，采用YWG-C18(5μm)4.6mm×250mm色谱柱，以甲醇—水—冰醋酸（330∶170∶5）为流动相，检测波长254nm，柱温40℃，本方法回收率为97.95％，RSD为2.83％，是一种简便、快速、准确的测定方法。

    大黄虫胶囊由熟大黄、水蛭、黄芩、白芍等组成。大黄虫丸为张仲景的名方，收载于历版药典，本方系其改变剂型，具有活血破瘀，通经消痞的功效，用于治疗肝炎。大黄为主药，大黄酸具有治疗肝炎的作用，为确保其质量与疗效，研究制订了HPLC法测定其中大黄酸含量的方法。大黄的含量测定方法据报道有HPLC、TLCS、UV法，其中HPLC法由于大黄中所含成分较多，大黄酸峰保留时间2～3倍后仍有色谱峰，给测定带来不便，杂质干扰大且费时，本文采用聚酰胺净化柱，根据大黄酸具有羧基，吸附能力较强的特性，洗脱除去杂质成分，采用本文流动相，色谱峰分离好，空白无干扰，回收率为97.95％，RSD为2.83％，是一种简便、快速、准确的测定方法。

　　1、实验部分

　　1.1 仪器、样品及试剂日本岛津LC-6A液相色谱仪及CR-4A数据处理机。大黄酸对照品由中国药品生物制品检定所提供。大黄虫胶囊由北京元亨保健品公司提供，批号为950301、950302、950303。聚酰胺80～100目，河南澧县一中试剂厂，批号880922。醋酸乙酯分析纯，甲醇、冰醋酸优级纯。

　　1.2 色谱条件色谱柱C184.6mm×250mm；流动相：甲醇—水—冰醋酸（330∶170∶5）；柱温：40℃；检测波长：254nm；理论塔板数按大黄酸峰计为3200。

　　1.3 实验条件的选择

　　1.3.1 最大吸收波长的选择经紫外全波长扫描，大黄酸在230和254nm处有最大吸收，本方法选用254nm处测定。

　　1.3.2 流动相的选择经比较选择本文所用流动相分离完全，杂质无干扰。

　　1.3.3 柱回收取大黄酸对照品的甲醇溶液加入聚酰胺柱中，用醋酸乙酯10mL洗脱，弃去洗脱液，再用50％甲醇—醋酸乙酯（1∶1）100mL洗脱，收集洗脱液蒸干，残渣加甲醇，定量转移至10mL量瓶中，摇匀，微孔滤膜滤过，注入色谱仪测定。5次测定，平均回收率为100.1％，RSD为0.47％。

　　1.4 实验方法和方法学考察

　　1.4.1 线性关系的考察精密吸取大黄酸对照品溶液(2.51mg→50mL)2、4、6、8、10mL，分别置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，分别精密量取20μL，注入液相色谱仪，以大黄酸进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。回归方程为：

　　Y=1684599.6X+26137.2r=0.9997

　　结果表明，大黄酸进样在0.2～1.0μg范围内呈线性关系。

　　1.4.2 精密度试验精密吸取大黄酸对照品溶液重复进样5次，峰面积的积分值的RSD为0.72％。

　　1.4.3 稳定性试验取大黄酸对照品的甲醇溶液，分别于配制后0、1、2、3、22、24、28h测定，结果表明，在28h内基本稳定。

　　1.4.4 重现性试验对同一批样品（批号950301）进行5次测定，求得RSD为1.42％。

　　1.4.5 空白试验按处方比例自配不含大黄的大黄虫胶囊同法测定，结果空白无干扰，见图1。

　　1.4.6 回收率试验精密称取已知含量的样品（批号为950301）约0.25g，分别精密加入大黄酸对照品的甲醇溶液(0.0028mg/mL)50mL，按供试品溶液制备项下制备并测定，5次测定结果平均回收率为97.95％，RSD为2.83％。

　　1.5 测定与结果

　　1.5.1 供试品溶液的制备取本品内容物约0.5g，精密称定，置锥形瓶中，精密加甲醇50mL，称定重量，置水浴上回流30min，放冷，加甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液25mL，蒸干，残渣加水10mL，盐酸0.8mL，置水浴中水解30min，冷却，移入分液漏斗中，用乙醚提取4次，第一次50mL，第二～四次30mL，合并乙醚液，加水10mL洗涤，弃去水层，分取乙醚层，蒸干，残渣加醋酸乙酯5mL，定量转移至已处理好的聚酰胺柱（内径0.9cm，1g，湿法装柱，用醋酸乙酯预洗）上，用醋酸乙酯10mL洗脱，弃去洗脱液，再用50％甲醇—醋酸乙酯（1∶1）100mL洗脱，收集洗脱液蒸干，残渣加甲醇，定量转移至10mL量瓶中，摇匀，微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。

　　1.5.2 对照品溶液的制备精密称取大黄酸对照品2.8mg，置200mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

　　1.5.3 样品测定分别精密吸取对照品和供试品溶液各20μL，注入色谱仪测定。

　　2、讨论

　　2.1 利用大黄酸含有羧基，采用聚酰胺柱分离大黄酸，并用HPLC法进行含量测定的方法，目前尚未见报道，本法柱回收率为100.1％（RSD为0.47％），是一种准确、快速的方法。

　　2.2 选用甲醇作溶剂，经测定加20、50、100mL甲醇提取30min所得结果基本一致，故选择加甲醇30mL。

　　2.3 取一定量甲醇溶液水解15、30、60min，选择水解30min。

　　2.4 聚酰胺柱可先用50％甲醇浸泡洗涤后，加50％甲醇—醋酸乙酯（1∶1）洗涤，再加醋酸乙酯洗涤后使用更佳。聚酰胺的目数对结果影响较大，商品聚酰胺的目数和实际目数有时相差较大，必要时应过筛。

　　2.5 曾试图采用加碳酸氢钠水溶液提取大黄酸再酸化后加乙醚提取的方法进行测定，但发现醚提取液蒸干时大黄酸含量变低，故未选用。