高效液相色谱法分析组合化学合成结构相似小分子多肽

摘要目的：为组合化学合成结构相似小分子多肽提供快速准确的HPLC分析方法。
方法：Resolv C₁₈柱(5μm，4.6mm×200mm)。流动相：乙腈-水（20∶80），内含0.1%三氟乙酸为流动相酸性调节剂。检测波长：214nm。
结果：目标多肽纯度范围26.36%～77.02%，迁移时间2.89～30.15min。7号多肽纯度和迁移时间的RSD分别为1.9%和1.4%。
结论：应用本方法可快速准确分离分析结构相似的小分子多肽，尤其是组合化学合成的多肽。

High Performance Liquid Chromatographic Analysis of Structurally
Similar Peptides by Combinatorial Chemistry Synthesis

Dong Wenyu，Guan Fuyu，Liang Minglin and Xu Hong
（Department of Pharmaceutics, 301 General Hospital of PLA, Beijing　100853）

AbstractObjective：To develop a HPLC method for assaying structurally similar peptides synthesized by combinatorial chemistry.
Method: With Resolv C₁₈ column(5 μm,4.6 mm×200 mm). Acetonitrile-H₂O(20∶80) as mobile phase, 0.1% trifluoroacetic acid used as acidic modifier. Detector at 214 nm.
Results: The purity of peptides ranges from 26.36% to 77.02%, migration time 2.89～30.15 min. The RSD of purity and migration time of sample 7 is 1.9% and 1.4% respectively.
Conclusion:This method provides a simple and feasible way to analyze structurally similar peptides especially those synthesized by combinatorial chemistry.
Key words　HPLC, combinatorial chemistry, peptides

　　80年代中期至今多肽化学合成技术有很大发展^［1～5］。合成的成品一般是以目标多肽为主的几种结构相似多肽的混合物，对多肽混合物的分离分析及纯度鉴定一直是一个重要问题。本文采用高效液相色谱法，优化流动相的组成，成功地将10种目标多肽与其它杂质分离。同时还成功地分析了胰岛素A链、胰岛素B链和水蛭素多肽。本方法快速、准确、重复性好。不仅为化学合成的大量多肽粗品提供快速准确的分析方法，确定目标多肽纯度，也为一般的多肽产品提供了一种常规的分析手段。

1　仪器与试样
HP1050高效液相色谱仪配四元泵系统，HP1040DAD二极管阵列检测器，HP1090/Pascal化学工作站。
乙腈为色谱纯，三氟乙酸为分析纯，双蒸水。
10种多肽粗品和水蛭素多肽溶液由多中心合成法合成^［6］（军事医学科学院毒物药物研究所化学合成室提供），胰岛素A链、胰岛素B链(Sigma公司产品)。

2　实验方法与结果
2.1　色谱条件　
色谱柱：ResolvC₁₈柱，粒径5μm，4.6mm×200mm(中国科学院大连化学物理研究所)；流动相：乙腈-水（内含0.1%三氟乙酸，pH 2.0），其组分配比和流速见表1；检测波长：214 nm；柱温：室温；进样量：5 μL。
2.2　样品溶液的配制　
10种多肽粗品、胰岛素A链和胰岛素B链分别用乙腈-0.01mol^.L^-1磷酸盐(60∶40，pH2.5)溶解，浓度约为1.0 m mol^.L^-1。10种多肽粗品溶液各取100μL混合得到混合样品。
2.3　流动相的优化　
由于多肽结构(见表1)很相似，可通过四元泵系统调节流动相的配比，寻找最佳流动相组成。本文考察了乙腈浓度分别为60%、40%、30%、25%、20%、15％时对7号多肽样品分离的影响，其中20%乙腈分离效果最好。对于其它出峰较慢的样品，可通过适当增加乙腈浓度(如升至25%～30%)或加大流速(升至1.5mL^.min)以缩短出峰时间。
2.4　多肽样品的分析　
通过适当调整流动相乙腈的含量，分析了10种多肽粗品、3种水蛭素多肽、胰岛素A链和胰岛素B链，结果目标多肽与杂质得到很好的分离(见图1)，归一化法得到主峰纯度和主峰的保留时间(见表1)。

表1　HPLC分析多肽粗品的结果

序号

多肽序列

流动相中乙腈量/%

流速/mL^.min^-1

主峰纯度/%

保留时间/min

1

Biotin-SGSGNCYPYDVP-OH

25

1.0

61.63

7.10

2

Biotin-SGSGCYPYDVPD-OH

20

1.0

54.30

14.89

3

Biotin-SGSGYPYDVPDY-OH

20

1.0

27.23

19.66

4

Biotin-SGSGPYDVPDYA-OH

20

1.0

26.36

15.18

5

Biotin-SGSGDVPDYASL-OH

20

1.5

43.52

10.29

6

Biotin-SGSGVPDYASLR-OH

20

1.5

63.00

16.16

7

Biotin-SGSGPDYASLRS-OH

20

1.0

77.02

9.46

8

Biotin-SGSGDYASLRSL-OH

20

1.0

51.36

30.15

9

Biotin-SGSGYASLRSLV-OH

25

1.5

67.69

17.36

10

Biotin-SGSGASLRSLVA-OH

25

1.5

73.89

6.90

11

胰岛素A链

15

1.0

66.74

4.77

12

胰岛素B链

25

1.0

60.05

2.89

13

H-QPKPQSHNPGDFEEIPEEYLQ-OH

30

1.0

59.04

4.51

14

H-TCKPQSHNPGDFEEIPEEY LQ-OH

30

1.0

59.12

4.97

15

H-TFKPQSHNPGDFEEIPEEYLQ-OH

30

1.0

67.26

6.76

　　注：Biotin为一生物活性基团，13～15号为水蛭素多肽，归一化法得到主峰纯度

图1　多肽粗品的HPLC色谱图
A.多肽粗品7号　B. 胰岛素A链　C. 水蛭素多肽

2.5　重复性的考察　
7号多肽粗品重复进样8次所得主峰出峰时间的RSD为1.4%、主峰纯度的RSD为1.9%，重复性很好。

3　讨论
3.1　三氟乙酸由于纯度高、良好的助溶性、低的紫外吸收而成为当前应用最为广泛的流动相酸性调节剂。本文以三氟乙酸为流动相酸性调节剂，考察乙腈-水不同配比时对多肽分离的影响。流动相乙腈含量在20%和流速在1.0 mL*min^-1，可将目标多肽与杂质基本分离，但对于多肽分离稍差的可适当调整流动相乙腈的浓度，达到最佳分离。文献报道对多肽的分析大多为梯度HPLC法，对仪器的要求较高。本实验所用液相色谱为四元泵系统，很容易调节流动相的配比。13～15号水蛭素多肽，与1～10号多肽相比，由于肽链增长，分子量增大，适当提高乙腈的浓度可达到出峰快分离好的目的。
3.2　本文对Sigma公司胰岛素A链和胰岛素B链标准品测定结果主峰纯度分别为66.74%和60.05%，而产品的标示纯度为90%和85%，表明本法的分离效率较高。

作者单位：中国人民解放军总医院 北京100853

参考文献
1　Geysen HM, Meloen RH, Barteling SJ. Use of peptide synthesis to probe viral antigens for epitopes to a resolution of a single amino acid. Proc Natl Acad Sci USA, 1984, 81: 3998
2　Houghten RA. General method for the rapid solid-phase synthesis of large number of peptides: specificity of antigen-antibody interaction at the level of individal amino acids. Proc Natl Acad Sci USA, 1985, 82:5131
3　Houghten RA, Pinilla C, Blondelle SE, et al. Generation and use of synthetic peptide combination libraries for basic research and drug discovery. Nature, 1991, 354:84
4　Fodor SPA, Read JL,Pirrung MC,et al. Light-directed spatially addressable parallel chemical synthesis. Science, 1991,251: 767
5　Echler J, Beyermann M, Bienrt M. Application of cellulose paper as support material in simultaneous solid- phase peptide synthesis. Collect Czech Chem Commun，1989, 54: 1746
6　Liu G, Wang JX, Guo L, et al. Simultaneous multiple peptide synthesis using the multipin method. 药学学报Acta Pharmaceutica sinica, 1996, 31(8): 591

收稿日期:1998-06-29