高效液相色谱法测定卡氏涂剂中间苯二酚和苯酚的含量

海军总医院药剂科　北京　100037

总后勤部药品仪器检验所　北京　100071

　　卡氏涂剂是皮肤科常用制剂，在临床上用于治疗头癣、股癣、手足癣等真菌感染，其主要成分为间苯二酚、苯酚等,用于杀菌止痒效果良好。对其含量测定，中国医院制剂规范采用溴量法测定间苯二酚的总量，但不能有效地控制2种成分的含量。目前同时测定这2种成分含量的方法未见报道。由于间苯二酚和苯酚均属于消毒防腐药,尤其是苯酚对皮肤粘膜有腐蚀作用，因此，确保其含量准确十分必要。本文建立了以ODS为柱填充剂，以甲醇—水(65∶35)为流动相的高效液相色谱法同时分离测定间苯二酚和苯酚的含量，方法准确、灵敏、快速。
1　仪器与试药
Waters 510 液相色谱仪，481紫外检测器，CDMC-5型色谱数据处理仪，ODS色谱柱。间苯二酚、苯酚（分析纯，北京化工厂），烟酸（化学纯，北京芳草医药化工研制公司），硼酸（分析纯，上海恒信化工厂）。甲醇、丙酮、无水乙醇均为分析纯，水为纯水。卡氏涂剂为本院自制。
2　实验方法与结果
2.1　色谱条件　色谱柱：大连化物所ODS柱，柱温：室温；流动相：甲醇—水(65∶35)；检测波长：271 nm；流速：0.6 mL/min；进样量20 μL；内标：烟酸。色谱图见图1。
2.2　标准曲线制备
2.2.1　内标液的配制　精密称取烟酸对照品4 mg于50 mL量瓶中，加65 ％甲醇至刻度，配成浓度为80 μg/mL的内标液。
2.2.2　间苯二酚标准曲线　精密称取间苯二酚52.0 mg置50 mL量瓶中,用65 %甲醇溶解并稀释至刻度，得贮备液。精密量取该液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，分别置于10 mL量瓶中,用65 %甲醇稀释至刻度。分别精密量取各浓度间苯二酚液1.0 mL,各精密加入内标液2.0 mL、0.2 mg/mL苯酚液1.0 mL，混匀,进样20 μL，以间苯二酚与内标的峰面积比A_间/A_内对间苯二酚浓度进行线性回归，得回归方程为：
C=0.3047A_间/A_内-0.01734　r=0.9999
间苯二酚在0.104～1.04 mg/mL范围内线性良好。

图1　卡式涂剂高效液相色谱图
1.烟酸　2.间苯二酚　3.苯酚

2.2.3　苯酚标准曲线　精密称取苯酚51.4 mg置50 mL容量瓶中,用65 %甲醇溶解并稀释至刻度，得贮备液，精密量取该液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、10.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中,用65 %甲醇稀释至刻度。分别精密量取各浓度的苯酚液1.0 mL,各精密加入内标液2.0 mL、0.6 mg/mL间苯二酚液1.0 mL,混匀,进样20 μL,以苯酚与内标的峰面积比A_苯/A_内对苯酚浓度进行线性回归得回归方程为：
C=0.2738A_苯/A_内-0.01858　r=0.9999
苯酚在0.0514～1.028 mg/mL范围内线性良好。
2.3　回收率测定　模拟处方比例配制不含间苯二酚、苯酚的溶液3份，准确加入一定量的间苯二酚和苯酚，使测定液中间苯二酚的浓度分别为0.208、0.416、0.624 mg/mL，苯酚的浓度分别为0.2056、0.4112、0.6168 mg/mL，分别精密取各溶液1.0 mL，各精密加纯水1.0 mL，内标液2.0 mL，混匀，进样20 μL，按选定的色谱条件，进行回收率测定，平均回收率和RSD分别为：间苯二酚100.2 ％和0.44 ％，苯酚101.8 ％和0.98 ％。
2.4　重现性考察　以65 ％甲醇精密配制含0.6240 mg/mL间苯二酚、0.2056 mg/mL苯酚的溶液分别在日内不同时间和日间进行HPLC分析，结果见表1，表明方法的重现性和稳定性较好。

表1　日内及日间精密度(%)

组分

日内RSD
(n=16)

日间RSD
(n＝4)

间苯二酚

0.83

0.69

苯　　酚

0.64

0.88

2.5　干扰性实验　按处方量配制含硼酸、乙醇、丙酮的溶液，并按样品分析方法稀释测定，各成分均不干扰苯酚、间苯二酚的含量测定。
2.6　样品分析结果　按处方配制3批样品，精密取样品1.0 mL，加65 %甲醇至10.0 mL(A液)，精密取A液5.0 mL，加65 %甲醇至50.0 mL(B液)，共100倍稀释，稀释3份。精取内标液2.0 mL，纯水1.0 mL，B液1.0 mL，混匀，进样20 μL，结果见表2。

表2　样品测定结果(%，n=3)

批号

间苯二酚

苯酚

标示量%

RSD

标示量%

RSD

980302

100.1

0.56

104.0

0.67

980306

98.58

0.78

101.3

0.82

980307

102.3

0.69

99.23

0.45

3　讨论
3.1　流动相的选择　以ODS为反相分析柱，我们曾用85∶15，70∶30，65∶35，60∶40，55∶45等不同比例的甲醇—水作流动相，对内标、苯酚、间苯二酚的分离效果、保留时间等进行考察，结果显示65∶35的比例分离效果最佳，在本文选择的色谱体系下，间苯二酚及苯酚、内标的色谱保留时间适当，峰形好，分离度高，系统稳定，重现性好。
3.2　检测波长的选择　将适当浓度的苯酚、间苯二酚溶液在200～400 nm扫描，苯酚的最大吸收波长为269 nm，间苯二酚的最大吸收波长为273 nm。因此，选定了271 nm为检测波长，在此波长下测定灵敏度较高。
3.3　内标物的选择　通过对异烟肼、苯甲酸、对苯二酚、烟酸等试剂的考察，我们发现烟酸的甲醇水溶液在紫外有吸收，且最大吸收波长与被测物苯酚、间苯二酚接近，E值较高，同时，烟酸在选定的色谱条件下，能够与被测物得到良好分离，且其峰面积和被测物的峰面积之比和被测物的浓度有良好的线性相关。

参考文献
1　　赵　辨主编.临床皮肤病学.第二版.江苏科学技术出版社，1988.1105
2　　王桂芳等.高效液相色谱法测定双癣药水中益康唑和克酶唑含量.中国医院药学杂志，1998，18(4)：157
3　　原永芳等.HPLC同时测定护肤粉刺霜中有效成分的含量.中国药学杂志，1998；33(1)：42

(本文于1998年8月22日修改回)