比格犬血浆中托烷司琼的HPLC法测定

(军事医学科学院毒物药物研究所　北京　100850)

　　摘要　　建立了比格犬血浆样品中托烷司琼的反相高效液相色谱检测法。血浆样品,加入盐酸三环哌酯作内标,用乙酸乙酯提取,经稀盐酸反洗,再用二氯甲烷提取。色谱条件:C₈柱;流动相:甲醇-水(55∶45),加0.3 %三乙胺,用冰醋酸调pH 7.2;检测波长283 nm。线性范围5.45～700 ng/mL,　最低检测浓度为3.0 ng/mL　,回收率为79.9 %～85.8 %,日内RSD为1.06 %～4.27 %,日间RSD为2.94 %～9.89 %。采用本法对比格犬口服托烷司琼的药代动力学进行了研究。
关键词：托烷司琼　高效液相色谱　药代动力学
托烷司琼(Tropisetron)是选择性5-HT₃受体拮抗剂，主要用于预防和治疗肿瘤患者由化疗引起的恶心、呕吐^［1～3］。为研究托烷司琼在动物体内的药代动力学,我们建立了比格犬血浆中托烷司琼的HPLC测定法。
1　仪器与试药
SP高效液相色谱仪，配有SP-1000型恒流泵，SP-2000型可变波长紫外检测器、SP-4600型色谱数据处理仪和AS-3000型全自动进样器。
对照品托烷司琼及内标物盐酸三环哌酯，含量分别为99.8 %和99.5 %,均由本所合成。
乙酸乙酯、二氯甲烷和三乙胺,均为分析纯,经重蒸后使用;甲醇,冰醋酸为优级纯。
2　色谱条件
色谱柱：C₈柱(150 mm×4.6 mm)，大连化物所；流动相：甲醇-水(55∶45)，加入0.3 %三乙胺，用冰醋酸调节pH=7.2，流速1.0 mL/min，检测波长283 nm。
3　方法与结果
3.1　标准贮备液的制备　准确称取托烷司琼和盐酸三环哌酯对照品适量,分别用甲醇配制成7.0 mg/mL和8.0 mg/mL的对照品贮备液。精确吸取托烷司琼对照品贮备液,用甲醇依次按梯度稀释为54.5～7000 ng/mL的工作液,同法将盐酸三环哌酯稀释为8.0 μg/mL的工作液。
3.2　样品的提取　犬血浆1.0 mL，加入内标(盐酸三环哌酯)工作液100 μL，混匀，再加入1.0 mol/L的碳酸氢钠溶液 0.3 mL进行碱化(pH=9)，用乙酸乙酯提取2次(3 mL×2),合并有机相。在有机相中加入0.25 mol/L的盐酸1.0 mL进行酸化,振荡旋摇1 min后离心分层，弃去上层有机相，在剩下的水相中加1.0 mol/L的氢氧化钠溶液0.2 mL及1.0 mol/L的碳酸氢钠溶液0.5 mL碱化，用二氯甲烷5 mL提取，提取液在40 ℃水浴中用氮气吹干，残渣用甲醇100 μL溶解，取50 μL进行色谱分析。
3.3　被测药物的确认　犬血浆样品提取物的色谱图见图1，可见，本文所采用的提取方法和色谱条件可较好地分离托烷司琼，内源性杂质对测定也无干扰，具有较好的特异性。
3.4　灵敏度　在空白血浆样品中加入不同量的托烷司琼对照品,经提取后测得的最低检测限为1.0 ng(信噪比为4),根据样品的处理方法及进样量,由方法的精密度确定托烷司琼的最低检测浓度为3.0 ng/mL。
3.5　线性关系　取不同浓度的托烷司琼工作液各100 μL,分别用犬空白血浆稀释至1.0 mL,使终浓度分别为5.45、21.9、43.8、175、350及700 ng/mL,加入内标工作液100 μL,按提取方法提取,进样测定峰面积。结果表明,在5.45～700 ng/mL的浓度范围内，托烷司琼浓度与托烷司琼及内标峰面积之比呈良好的线性关系，回归方程为:
Y=0.0105+5.28X　r=0.9984　n=4

图1　犬血浆提取液的色谱图
A.空白样品　B.外加托烷司琼标准
C.给药后的样品
1.托烷司琼　2.三环哌酯(内标)

3.6　回收率　取不同浓度的托烷司琼工作液各100 μL,分别用犬空白血浆稀释至1.0 mL,使终浓度分别为10.9、175和700 ng/mL,按提取方法提取,进样测定托烷司琼的峰面积,与相同浓度托烷司琼的对照品溶液直接进样测得的峰面积比较,计算方法的提取回收率,结果3种浓度的回收率分别为85.85 %,79.90 %和83.63 %,RSD分别为7.66 %,8.74 %和4.72 %,n=4。
3.7　精密度　取不同浓度的托烷司琼工作液各100 μL,分别用犬空白血浆稀释至1.0 mL,使终浓度分别为10.9、175及700 ng/mL,加入内标工作液100 μL,按提取方法提取,进样测定托烷司琼的浓度,计算方法的日内和日间精密度,结果3种浓度的日内RSD分别为4.27 %、4.90 %和1.06 %,日间RSD分别为9.89 %、2.94 %和4.65 %,n=4。
3.8　托烷司琼在比格犬体内的药代动力学　比格犬4条,雄性,体重(11.7±1.3)kg,分别灌胃托烷司琼各20mg,给药后分别在不同时间抽取静脉血3 mL,肝素抗凝,离心分离血浆,准确吸取1.0 mL,-20℃冰箱保存。血浆样品按方法提取并测定血药浓度,药-时曲线见图2。对血药浓度数据用3P87药代动力学程序进行曲线拟合,并计算相应的药代动力学参数,结果见表1。

图2　比格犬灌胃托烷司琼(20 mg)后
的药-时曲线(n=4)

表1　比格犬灌胃托烷司琼的药代动力学参数(n=4)

参数

单位

犬1

犬2

犬3

犬4

±SD

吸收半衰期(t_1/2Ka)

h

0.22

0.26

0.19

0.12

0.20±0.06

消除半衰期(t_1/2β)

h

2.32

1.59

2.32

2.04

2.07±0.34

达峰时间(t_max)

h

0.83

0.86

0.74

0.64

0.77±0.10

峰浓度(C_max)

ng/mL

61.56

131.10

158.46

96.25

111.84±42.09

表观分布容积(V/F)

L/kg

19.46

10.21

9.19

15.73

13.66±4.83

清除率(Cl/F)

L/(h*kg)

5.82

4.45

2.75

5.36

4.59±1.35

4　讨论
由于托烷司琼是胺类化合物,在色谱行为中拖尾较严重,我们采用以C₈柱代替C₁₈柱以及在流动相中加入少量三乙胺可明显地改善峰形。
在提取方法的选择中,比较了几种溶剂的提取回收率,虽然乙醚的提取回收率较高,但内标盐酸三环哌酯在乙醚中不稳定。本实验采用乙酸乙酯提取,回收率高,同时可减少乳化现象,经0.25 mol/L盐酸酸化反洗可有效去除血浆中的脂溶性杂质,最后用二氯甲烷提取,便于溶剂的挥干。
本文测定方法也可应用到其他体液或组织中托烷司琼的含量测定。

参考文献
1　　Fischer V,et al.Pharmacokinetics and metabolism of 5-hydroxytryptamine antagonist tropisetron after single oral doses in humans. Drug Metab Dispos,1992,20(4):603
2　　Hoyer D,et al.Competitive interaction of agonists and antagonists with 5-HT₃ recognition site in membranes of neuroblastoma cells labelled with [³H]ICS 205-930.J Recept Res,1989,9(1):65
3　　Hoyer D,et al.Palacios: 5-HT₃ recognition sites in the central and peripheral nervous systems: autoradiographic and radioligand binding studies.Br J Pharmacol,1989,96(suppl):7p

(本文于1997年10月17日收到)

Determination of Tropisetron in Beagle Dogs’ Plasma by HPLC

Ge Zhaoheng,Qiao Jianzhong,Jiang Xiaoguo,Yuan Shulan and Ruan Jinxiu
(Institute of Pharmacology and Toxicology,Academy of Military Medical Sciences,Beijing,100850)

　　Abstract:A reversed-phase high performance liquid chromatographic method is described for the determination of tropisetron in plasma of beagle dogs.Tropisetron in plasma was extracted with ethyl acetate after the addition of the internal standard tricyclopinate hydrochloride.The organic phase was re-extracted with dilute hydrochloric acid and the aqueous phase was back-extracted with dichloromethane.After the extract was evaporated to dryness,the residue was dissolved in methanol and then separated on a C₈ column.The mobile phase consisted of methanol-water(55∶45)with 0.3 % triethylamine and was adjusted to pH 7.2 by acetic acid.The detector was set at UV 283 nm.The linear range of the calibration curve was 5.45～700 ng/mL and the minimal detectable concentration was 3.0 ng/mL.The recovery of the method was 79.9 %～85.8 %.The within-day and between-day precisions were 1.06 %～4.27 % and 2.94 %～9.89 %,respectively.The method has been applied to the pharmacokinetic study of tropisetron in beagle dogs after po 20 mg.
　　Key words:tropisetron,HPLC,pharmacokinetics

*九六级实习生，现在解放军304医院工作