柱前衍生化高效液相色谱法拆分人体血浆和尿液中阿替洛尔对映体的研究*

(广东省心血管病研究所临床药理室　广州　510080)

摘要　　高效液相色谱法分离和测定人体血浆和尿液中S(-)-和R(+)-阿替洛尔对映体。选用盐酸甲氧胺为内标，R(+)-苯乙基异氰酸酯为衍生化试剂，ODS为固定相，流动相为水-甲醇-异丙醇-二氯甲烷（53.2∶41.6∶4.8∶0.4），荧光检测波长235/300 nm(Ex/Em)。血、尿样品经碱化后乙酸乙酯提取，并用氯仿2次抽提。S(-)-和R(+)-阿替洛尔对映体血、尿样品的线性范围分别为10～1000 ng/mL和25～1500 ng/mL，绝对回收率均在84 %以上，RSD均小于6.0 %。此法已经用于阿替洛尔对映体的药代动力学和药效学研究。
关键词：阿替洛尔　对映体　高效液相色谱法　衍生化法

　　阿替洛尔(Atenolol,AT)为选择性β₁受体阻滞剂，存在着对映异构体(enantiomers)，目前临床上使用的制剂均以S和R对映体各半混合的外消旋体(racemate)形式给药^［1,2］。2种对映体不仅在药理作用的类型、强度而且在生物体内的吸收、分布、代谢等方面都存在显著差异^［3,4］。因此，分离和测定生物体液中的AT对映体十分必要和具有重要意义。为了研究AT对映体的药代动力学和药效学，本文采用苯乙基异氰酸酯作为衍生化试剂，建立了柱前衍生化HPLC法，用于拆分人体血浆和尿液中的AT对映体。
1　试药与仪器
S(-)-AT和R(+)-AT购自Aldrich公司，内标盐酸甲氧胺(Methoxamine HCl) 标准品购自Sigma公司。消旋AT标准品，含量＞99 %，由天津中央药厂提供。盐酸阿替洛尔片：50 mg/片，为市售药品。手性衍生化试剂R(+)-苯乙基异氰酸酯（R(+)-1-Phenylethylisocyanate,R(+)-PEIC）购自Fluka公司。水为三蒸水。其它试剂均为国产分析纯。
高效液相色谱仪(美国惠普公司)，包括HP1050泵、1046A荧光检测器、ODS Hypersil（250 mm×4 mm,5 μm）色谱柱和1050色谱工作站。
2　实验方法
2.1　标准液的配制　盐酸甲氧胺、消旋AT、S(-)-AT和R(+)-AT分别用甲醇配制成储备液，贮存于4℃冰箱，每次使用前再以甲醇稀释成各种浓度的工作液。手性衍生化试剂R(+)-PEIC避光贮存于冰箱，临用前以氯仿稀释（1∶400）。
2.2　HPLC色谱条件　流动相：水-甲醇-异丙醇-二氯甲烷（53.2∶41.6∶4.8∶0.4）；流速1.0 mL/min，柱温25 ℃；检测波长：λ_Ex＝235 nm，λ_Em＝300 nm。进样量：20 μL。
2.3　血、尿标本的提取和衍生化　取血浆0.5 mL或尿液0.2 mL，加入内标溶液（100 ng/μL）8 μL，尿液样品再加三蒸水稀释5倍至总体积为1 mL。混匀后各加1 mol/L氢氧化钠溶液0.1 mL碱化样品，振荡10 s，再加入乙酸乙酯3 mL，异丙醇0.15 mL，水平振荡5 min，2000 r/min离心5 min,取上层有机溶液40 ℃水浴氮气流下挥干。残渣加入浓氨水2 μL及0.25 % R(+)-PEIC氯仿液0.2 mL，旋涡振荡30 s，4 ℃冰箱放置15 min，室温氮气挥干有机溶液后，加入水0.5 mL，氯仿2 mL，用于提取、纯化衍生化反应物，振摇30 s后，1500 r/min离心3 min，40 ℃水浴氮气流下挥干有机溶液，残渣用60 μL流动相溶解，待测。
3　结果
3.1　色谱行为　图1和图2分别为空白血浆、空白尿液外加内标和人口服AT后血浆、尿液样品AT对映体拆分的色谱图。内标亦为对映体化合物，在相同的色谱衍生条件下发生不完全分离。AT对映体拆分完全，峰形对称，与内标有很好的分离且无杂质干扰。

图1　血浆中AT对映体HPLC色谱图
a.空白血浆　b.受试者血浆
1.S(-)-AT　2.R(+)-AT　3.内标

图2　尿液中AT对映体HPLC色谱图
a.空白尿液　b.受试者尿液
1.S(-)-AT　2.R(+)-AT　3.内标

3.2　线性关系
3.2.1　血浆　精取S(-)-AT和R(+)-AT标准储备液配制成浓度为10、50、100、250、500、1000 ng/mL的AT对映体的血浆样品，余下按样品提取和衍生化处理操作。以浓度(X)为横坐标，以S(-)-AT、R(+)-AT与内标的峰面积之比(Y)为纵坐标，得血浆中S(-)-AT、R(+)-AT标准曲线的回归方程分别为：
Y＝0.00140X＋0.03914　r＝0.9915
Y＝0.00151X＋0.04123　r＝0.9937
3.2.2　尿液　取S(-)-AT和R(+)-AT标准储备液配制成浓度为25、50、750、1000、1500 ng/mL的标准溶液，以下步骤同尿液样品处理。以浓度(X)为横坐标，以S(-)-AT、R(+)-AT与内标的峰面积之比(Y)为纵坐标，得尿液中S(-)-AT、R(+)-AT标准曲线回归方程分别为：
Y＝0.00034X＋0.03553　r＝0.9952
Y＝0.00036X＋0.02630　r＝0.9963
3.3　回收率　用正常人空白血浆和尿液分别配制成浓度为10、200、1000 ng/mL血浆和浓度分别为25、750、1500 ng/mL的尿液标准样品，依样品提取与衍生化操作，得到血浆和尿液AT对映体的提取液，将提取处理后进行衍生化反应与未提取直接衍生化所得的色谱峰面积比较，计算绝对回收率。血浆标本：S(-)-AT回收率＞85.7 %；R(+)-AT回收率＞86.3 %。尿液标本：S(-)-AT回收率＞84.8 %；R(+)-AT回收率＞85.5 %。
3.4　精密度试验
3.4.1　血浆标本　1天内提取回收3种浓度(10、200、1000 ng/mL)的S(-)-AT和R(+)-AT，在上述色谱条件下测定4次，计算日内误差，RSD范围：S(-)-AT为1.7 %～4.3 %；R(+)-AT为1.3 %～3.8 %。3种浓度分散于3个月内各测定5次，计算日间误差，RSD范围：S(-)-AT为2.8 %～5.0 %；R(+)-AT为2.9 %～4.6 %。
3.4.2　尿液标本　用3种不同浓度(25、750、1500 ng/mL)的尿液样品，每种浓度1天内连续进样4次，得日内误差，RSD范围：S(-)-AT为0.6 %～2.0 %；R(+)-AT为0.8 %～1.9 %。3种浓度分散于3个月内各测定5次，得日间误差，RSD范围：S (-)-AT为1.0 %～2.4 %；R(+)-AT为1.0 %～2.0 %。
4　方法的应用
12名健康男性志愿者单次口服盐酸阿替洛尔片2片(即AT为100mg)后，于服药前和服药后0.5、1、1.5、2、3、4、6、9、12、24 h取外周静脉血以及服药后分段收集0～3、3～6、6～9、9～12、12～24 h的尿液，采用本法分别测定血浆和尿液AT对映体的浓度C。结果显示血浆R(+)-AT浓度较S(-)-AT显著升高，S(-)-AT的AUC为(2.44±0.59)(μg/mL)*h，R(+)-AT为(2.64±0.61(μg/mL)*h(P＜0.05)，两对映体的消除半衰期(T_1/2)基本相近，S(-)-AT为(5.78±0.70)h，R(+)-AT为(6.03±0.71)h(P＞0.05)；而尿液S (-)-AT肾清除率(Cl)显著大于R(+)-AT，S(-)-AT为(115.69±19.40)mL/min，R(+)-AT为(108.91±21.26)mL/min(P＜0.05)。尿液计算的两对映体的T_1/2也基本相近，S(-)型为(6.35±2.98)h，R(-)型为(6.96±4.22)h(P＞0.05)，结果显示，AT对映体人体药代动力学过程存在立体选择性差异。见图3和图4。

图3　12名健康受试者单剂量口服AT
100 mg血浆对映体的平均药时曲线
1.S(-)-AT　2.R(+)-AT

5　讨论
5.1　本研究通过改变流动相的组成和极性，发现在流动相中加入异丙醇能明显缩短保留时间，加入少量二氯甲烷能消除拖尾，提高分离度。提取方法上考虑到乙酸乙酯提取回收率高但杂质峰较多，因此采用氯仿进行第二次抽提和纯化。在此条件下，S (-)-AT和R(+)-AT衍生物分离良好且无杂质峰干扰，保留时间小于15 min。

图4　12名健康受试者单剂量口服AT
100 mg尿液对映体平均药时曲线
1.S(-)-AT　2.R(+)-AT

5.2　R(+)-PEIC的含量影响衍生化反应。本实验曾选用0.008 %～0.5 %不同浓度的R(+)-PEIC氯仿液进行衍生化，结果显示R(+)-PEIC浓度太低时，样品衍生化不完全，但随着浓度增加，S(-)-AT和R(+)-AT衍生物相应增加，溶剂峰也随之明显增多，当R(+)-PEIC增加到一定浓度(0.5 %)时，衍生化反应趋于饱和状态，再增加R(+)-PEIC含量时，衍生物的生成并不增加。R(+)-PEIC活性较强，如温度过高或暴露于空气之中易于氧化^［5］，因此AT的衍生化反应在4 ℃冰箱放置15 min，这样不仅避免了R(+)-PEIC的氧化代谢，而且能得到单一、稳定、具有很强荧光的酰脲衍生物，此衍生物于室温放置至少48 h无变化。
5.3　手性衍生化反应给内标的选择带来了一定的困难。我们选择盐酸甲氧胺作为内标，因为其为拟肾上腺素类药，结构与AT相似，其与R(+)-PEIC衍生化反应后荧光光谱响应类似AT，因此同样色谱条件下也分出2个洗脱峰（即对映体)，取两对映体峰面积之和作为内标计算值。
5.4　采用柱前衍生化方法测定血浆和尿液中AT对映体需较纯的提取物，以减少杂质峰的干扰。另外，碱化样品能增加回收率，但碱性过高，杂峰也随之增多。本法采用1 mol/L氢氧化钠溶液0.1 mL碱化血浆和尿液，使pH高于AT pKa 1～2单位，并于乙酸乙酯中加入少量异丙醇能显著提高回收率。
5.5　AT为水溶性药物，吸收后几乎全部以原形从尿液排出，故尿液中药物浓度高。另外，考虑到衍生剂的量足以使衍生化反应完全，因此作尿液药物分析时，样品均先稀释5～30倍，然后进行提取和衍生化反应。
5.6　实验精密度表明，本法测定结果稳定，具有良好的重现性，生成的酰脲衍生物单一、稳定，具有很强荧光。实际应用证明，本法能够满足血药浓度监测和药代动力学研究的需要。

参考文献
1　　Riddell J G,et al.Clinical pharmacokinetics of beta-adrenoceptor antagonists.Clin Pharmacokinet,1987,12(5):305
2　　Wilsin M J,et al.Preparative resolution of the enantiomers of the beta-blocking drug atenolol by chiral derivatization and high-performance liquid chromatography.J Chromatogr,1988,431:222
3　　Jamali F,et al.Enantioselective aspects of drug action and disposition:therapeutic pitfalls.J Pharm Sci,1989,78(9):659
4　　余细勇等.手性药物对映体的药动学与药效学立体选择性差异研究进展.广州医药,1997,28(3):1
5　　程增江.HPLC法在分离和测定药物对映体中的应用.国外医学药学分册,1992,19:32

(本文于1997年9月8日收到)

Study on Precolumn Derivatization HPLC Assay
Method of Atenolol Enantiomers in Human Plasma and Urine

Wang Xiaomei,Yu Xiyong and Lin Shuguang
(Department of Clinical Pharmacology,Guangdong Cardiovascular Institute,Guangzhou,510080)

　　Abstract:A new HPLC method was developed for the determination of atenolol(AT) enantiomers in plasma and urine after derivatization with a homochiral reagent.Methoxamine HCl was used as the internal standard,R(+)-PEIC as a homochiral reagent.Separation was carried out on a 250 mm×4 mm×5 μm ODS Hypersil column and a mobile phase of water-ethanol-isopropanol-dichloromethane(53.2∶41.6∶4.8∶0.4).Fluorescent detector set at an excitation wavelength of 235 nm with an emission wavelength of 300 nm.Plasma samples and urine samples diluted with water were extracted with ethyl acetate,and chloroform subsequently.The standard curves for the enantiomers were linear over the range of 10～1000 ng/mL in plasma and 25～1500 ng/mL in urine.The minimal absolute recoveries of S-atenolol,R-atenolol were over 84.8 %,respectively and the maximal RSD was 5.0 %.The method has been used in pharmacokinetics and pharmacodynamics of atenolol enantiomers.
　　Key words:atenolol(AT),enantiomers,HPLC,chemical derivarization

*广东省自然科学基金资助课题，批准文号：930954