高效液相色谱法分析人参皂苷

(保定市药品检验所　保定　071000)

(河北大学理化分析中心　保定　071002)

　　人参(Panax ginseng G.A.Meyer)是我国珍贵的传统中药，具有滋补、强壮、抗疲劳等多方面的药理和生物活性。人参皂苷是其主要活性成分，目前，已知的人参皂苷有30多种^［1，2］。人参皂苷按结构可分为2种类型：(1)达马烷型(Dammarane Type)四环三萜皂苷，水解后生成皂苷元人参二醇或人参三醇，(2)齐墩果烷型(Oleanane Type)五环三萜皂苷，水解后，皂苷元为齐墩果酸(Oleanolic acid)。
人参皂苷的分析方法较多，如分光光度法^［3］、比色法^［4］、薄层扫描法^［5］、气相色谱(GC)法^［6］等，其中比色法空白太深，有干扰，而气相色谱方法虽然灵敏度较高，但样品制备比较费时，需要水解以及衍生成可挥发性衍生物。并且GC的最大缺点是只能对人参二醇和人参三醇分析，只有2个色谱峰。高效液相色谱法(HPLC)^{［1，2，7～30］}在分离定量方面有许多优势，分离效果好、准确、快速、样品制备简单等，在人参皂苷的分析中应用较多。本文将HPLC分析人参皂苷的情况作一简要介绍。
1　分离
人参皂苷的高效液相色谱分析始于70年代末，随后得到了广泛发展。正相、反相色谱均有应用，其分离所用的层析柱和固定相有近10种。用得较多的有ODS柱、NH₂基柱及离子交换柱等。
采用Superspher RP18柱经线性梯度洗脱已分离了22种人参单体皂苷^［7］。Kanazawa等^［8］采用MPG—ODS柱进行分离，并且比较了ODS柱与MPG—ODS柱分析10种人参单体皂苷的结果，证明MPG—ODS柱分离效果好，容量因子也小，特别是对人参皂苷Rg₁和Re的分离，MPG—ODS柱比ODS柱好。
采用恒溶剂系统时，NH₂基柱同时分离人参单体皂苷Rg₁和Re与其它单体皂苷^［9，10］的分离效果较ODS柱好。
在碱性离子交换柱上采用硼酸盐络合方式可用于人参皂苷的分析和制备性分离。其原理是硼酸与具有顺邻—二羟基或空间顺邻—二羟基的皂苷发生络合，首先被洗脱下来，不具有上述结构的皂苷则与其分离，该方法特别适用于分离异构糖苷，用的柱子为Asahipak ES—502N柱^［11］。
微柱也有应用，微柱Silasorb C₁₈(4.5μm)和Spherisorb ODS(5μm)对参根中的Rg₁、Re、Rf₁、Rc、Rb₁、Rb₂和Rd进行了分离测定^［12］。
早期的工作，主要是吸附或正相分离方式，如μ Porasil柱^［13］、μ Bondapak Carbohydrate柱^［13］、Carbohydrate Analysis柱^［14］等均有应用。
在分离中，采用乙腈—水为流动相的最多，应用ODS柱或MPG—ODS柱时，最困难的是人参单体皂苷Rg₁和Re与其它单体皂苷如Rb₁、Rc和Rd等的分离，以前一般采用2种流动相系统^{［15～17］}，一种流动相用来分离Re和Rg₁，另一种流动相则分离其它人参皂苷。现在多采用梯度洗脱^{［1，2，7，8，18，19］}来实现Rg₁、Re与其它人参皂苷的分离。在文献中^［1］以Rg₁和Re的分离评价了6种柱的分离度，6种柱为μ Bondapak,LiChrosorb,Nucleosil,Spherisorb,Techopak,Zorbax，填料均为ODS键合相，结果，最好的为Nucleosil，同时采用梯度洗脱。
另外，在流动相中加入磷酸盐缓冲液^{［2，7，8，19，20］}或加入醋酸铵缓冲液^［17］均可以改善分离。
乙腈—水作为正相色谱的流动相也有应用^［21］，与新柱hard spherical hydroxylapatite配合使用分离人参皂苷，结果比用硅胶柱好。
周志华等^［22］采用甲醇—乙腈—乙二醇—0.14mol/L醋酸铵(30∶70∶5∶10.6)为流动相配合NH₂基柱，分离了6种主要皂苷。
对人参制剂的分离、测定已有不少应用，但仅局限于少数几种人参皂苷的分析。
2　检测
HPLC分离后，常用示差折光检测(RI)^{［16，22～25］}和紫外检测(UV)^{［1，2，7，8，12，17～21，26～28］}，偶见脉冲电流检测(PAD)^［29］、荧光检测^［8］以及蒸发光散射检测(ELSD)^［10］的报道。
示差折光检测的灵敏度差，检出限为1μg，而且受温度影响大。人参皂苷缺乏发色团，Besso等^［30］采用HPLC柱前衍生，人参皂苷与苯甲酰氯在吡啶溶液中生成紫外吸收较强的衍生物，然后再经HPLC分离，UV检测。后来则使用较低的紫外检测波长，一般为203nm，检出限约为100ng，检测时受背景和其它化合物的干扰大，使用远紫外级乙腈与磷酸二氢盐缓冲液作线性梯度洗脱，在5μm C₁₈柱上，198nm检测，灵敏度是203nm的1.5倍^［2］。
Park等^［8］采用NH₂基柱，以乙腈—2-特丁基蒽醌(t-BAQ)溶液为流动相，光还原检测人参皂苷，洗脱液通过一个缠绕在10W—UV灯上的45cm—PTFE毛细管，使2-特丁基蒽醌还原为高荧光的二羟基蒽衍生物，荧光检测，该方法Rg₁的检出限为130ng，与UV检测的检出限相当，但该方法降低了其它化合物的干扰，提高了选择性。有关该反应的装置见图1。

图1　光还原荧光检测的装置(A)与光化学反应器(B)^［9］
1.45cm PTFE线圈　2.10W UV灯3.O—环　4.聚氯乙烯(PVC)管

　　离子色谱—脉冲安培检测(IC/PAD)^［29］获得了目前HPLC检测人参皂苷的最高灵敏度，检出限Re为0.8ng，Rg₁为1.0ng，该方法以Carbopac PA1或HPIC—AS4A阴离子交换柱配合1mol/L氢氧化钠为流动相，分离人参三醇型皂苷效果好，但分离人参二醇型皂苷不太理想。
蒸发光散射检测(ELSD)是一种通用检测方法，已成功地应用于不挥发成分，如糖类、脂类以及表面活性剂的分析，其原理是热气流使流动相喷雾热气化，进入加热管，使溶剂挥发，所得被测物质颗粒通过一狭窄光束散射光由光电倍增管收集。ELSD的响应取决于被分析质粒的数量和大小。它只对不挥发分析物产生响应，梯度洗脱时能得到平稳的基线，因此，HPLC—ELSD法用于人参皂苷的分析，其在灵敏度和分离性能方面均优于HPLC—UV法，检测限Rg₁为50ng，Rd为40ng，Re为65ng^［10］。
表1列出了人参皂苷的HPLC的分离检测条件。

表1　人参皂苷的HPLC的分离、检测条件

样品类型

固定相　　　　　

流动相　　　　　　　　

检测方法及条件

参考文献

人参片剂、胶囊、
液体制剂

1. μBondapak TM C₁₈
10μm(15cm×3.9mm)

乙腈—水　　梯度

UV 203nm

1

2. LiChrosorb RP-18
5μm(12.5cm×4.0mm)

3. Nucleosil C₁₈
5μm(15.0cm×4.6mm)

4. Spherisorb ODS

5. Techopak C₁₈
10μm(15.0cm×3.9mm)

6. Zorbax ODS
7μm(15.0cm×4.6mm)

人参根

Superspher RP-18(25cm×4mm)
温度程序控制

乙腈—水—0.1%磷酸
(21∶72∶8)与乙腈　　梯度

UV 202nm

7

人参

MPG—ODS
5或10μm(15cm×4.0mm)

乙腈—50m mol/L磷酸二氢钾
不用梯度或线性梯度

UV 203nm

8

红参、白参

LiChrosorb NH₂
(250mm×4mm)5μm和

(A)乙腈—水—2-异丙醇
(80∶5∶15)

蒸发光散射检测

10

Capcell Pak NH₂
(250mm×4.6mm)5μm

(B)乙腈—水—2-异丙醇
(80∶20∶15)　　梯度

人参、西洋参、
人参制剂

μ Bondapak C₁₈
(3.9mm×30mm)

乙腈—水
(3∶7或18∶82)

RI

16

红参、玉参、
西洋参口服液

Hitachi MPG-ODS
(150mm×4mm)

乙腈—0.0167mol/L醋酸铵(27∶13)
乙腈—0.025mol/L醋酸铵(15∶85)

UV 204nm

17

参根

Column(6.2 or 6.4cm×2mm)
Packed with Silasorb C₁₈(5μm)
或Separon C₁₈(5μm)

20%～25% or 27%～50%乙腈水溶液
梯度

UV 204nm

18

人参、白参、西洋
参、红参

Alltech adsorbosphere HS-C₁₈
5μm(25cm×4.6mm)

30%～90%乙腈水溶液
与50m mol/L磷酸二氢钠　　梯度

UV 203nm

19

酸性及中性皂苷

MPG—ODS
(150mm×4mm)

乙腈－50m mol/L磷酸二氢钾
(25.5∶74.5)

UV 203nm

20

五珍参加液

Dupont NH₂
(4.6mm×250mm)

甲醇—乙醇—醋酸铵(0.14mol/L,pH6)
—水(30∶70∶5∶7.6∶5)

RI

23

人参皂苷

μ Bondapak CH
(300mm×3.9mm)

乙腈—水(80∶20)

RI

24

天然糖苷

Nucleosil 50-5柱
(25cm×4.6mm)硅胶

氯仿—甲醇—水
(30∶17∶2)

RI

25

人参皂苷

MPG—ODS(15cm×4mm)

25.5%乙腈水溶液

UV 203nm

26

人参根、叶、
人参制剂

TSK gel OD-120TS
(25cm×4.6mm)

27%乙腈水溶液

UV 203nm

27

古方生脉散制剂

Inertsil ODS-2

乙腈—0.05%磷酸(19∶81)

UV 203nm

28

　　HPLC分离后，与其它技术联用，如HPLC—MS(质谱)^［12］，HPLC—IR(红外光谱)^［13］，HPLC—FD—MS(场解吸质谱)^［15］，HPLC—MIR—IR(多内反射红外光谱)^［15］等，可以更好地对色谱峰进行定性，保证人参单体皂苷分析的准确性。
3　样品处理
人参的样品处理一般以醇(甲醇或乙醇)提取，以醚或氯仿脱脂后，以Sep-Pak C₁₈柱或大孔吸附树脂处理，或以水饱和正丁醇多次萃取净化，减压蒸干，以流动相或甲醇等溶剂定容后进行色谱分析。
4　结语
综上所述，高效液相色谱法(HPLC)分析人参皂苷，在分离、检测、样品处理等方面，目前已取得一定进展，但仍不能满足实际分析的需要，如分离效果、分析的灵敏度、精确度等方面均需进一步提高，尤其是现有的HPLC分析方法检测限为ng级，还不能满足今后的分析需要，因此，如何提高灵敏度，研究新的HPLC检测方法，是今后工作的方向之一，其中寻找灵敏的衍生试剂，开发柱前、柱后衍生反应，使紫外吸收灵敏度提高，使用电化学检测或荧光检测以及开发新的高灵敏检测器都有可能进一步提高灵敏度。

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(本文于1997年4月9日收到)