反相高效液相色谱法测定洛伐他汀的血浆药物浓度

(哈尔滨医科大学附属二院临床药学药物研究所　150086)

摘要　　采用反相高效液相色谱法测定血浆中洛伐他汀浓度，色谱柱采用Nova-Pak C₁₈柱(4μm,3.9mm×150mm)，柱温控制在50℃，流动相为乙腈—磷酸铵缓冲液(0.05mol/mL，pH3.7)(48∶55，V/V)，检测波长为238nm，血浆样品应用SPE固相小柱萃取。方法的线性范围为5～500ng/mL，最低检测浓度为5ng/mL，10、100、500ng/mL 3种浓度的平均回收率为(92.43±7.18)%，日内、日间RSD均小于8%。
关键词：高效液相色谱法　洛伐他汀　血药浓度
洛伐他汀(Lovastatin)为甲基羟戊二酰辅酶A(HMC—CoA)还原酶抑制剂，抑制内源性胆固醇的合成，为血脂调节剂。临床上主要用于治疗高胆固醇血症等。洛伐他汀血药浓度测定方法国外报道有气质联用法(GC—MS)，生物法^［1］和高效液相色谱法^［2］。本文参考国外文献，结合实际情况，建立了洛伐他汀血浆药物浓度的高效液相色谱测定方法，旨在为人体药代动力学和生物利用度研究提供测定方法。1　实验材料及方法
1.1　药品及试剂　洛伐他汀供试胶囊由黑龙江肇东华富药业有限公司提供，规格为20mg/粒；洛伐他汀对照品由黑龙江肇东华富药业有限公司提供，经黑龙江药检所检测(HPLC法)，纯度为99.9%；乙腈为色谱纯，甲醇、磷酸二氢铵、磷酸二氢钾和磷酸均为分析纯，水为超纯水。
1.2　仪器及材料　Waters系列高效液相色谱仪，包括600E泵，717自动进样器，996二极管阵列检测器和2010 Millenium色谱管理系统；离心机(北京离心机厂)；液体快速混合器(北京长安仪器厂)；纯水制备仪(密理博公司)；SPE C₁₈固相萃取小柱(2.5mL/200mg，大连化物所色谱中心)。
1.3　对照溶液　贮备液为1mg/mL乙腈溶液，工作溶液由贮备液逐级稀释为50、100、250、500、1000、2500、5000ng/mL溶液，4℃冰箱存放备用。
1.4　色谱条件　采用Nova-Pak C₁₈柱(4μm,3.9mm×150mm)和Nova-Pak C₁₈预柱，柱温50℃，流动相为乙腈—磷酸铵缓冲液(0.05mol/mL，pH3.7)(48∶55，V/V)，流速为1.5mL/min，检测波长为238nm。
1.5　血浆样品制备　取肝素抗凝的血浆1mL，加入磷酸二氢钾缓冲液(0.1mol/mL，pH7.2)1mL，振荡混匀后将其通过已活化的SPE C₁₈固相小柱，用磷酸二氢钾缓冲液2mL洗涤，再用乙腈—磷酸二氢钾缓冲液(1∶9)洗涤，以上洗涤液均弃去，最后用乙腈—水(75∶25)2mL洗涤，收集洗脱液，在50℃水浴中氮气挥干，以流动相200μL溶解，取20μL进样。
2　结果
2.1　血浆中洛伐他汀标准曲线制备　取肝素抗凝的血浆1mL，分别加入不同浓度的洛伐他汀工作液100μL，使血浆中终浓度分别为5、10、25、50、100、250、500ng/mL，按“血浆样品的制备”项下操作，记录样品峰面积，以样品峰面积A对浓度C作线性回归，得出回归方程：
C＝2.73+6.05×10^-3A　r＝0.9989
线性范围为5～500ng/mL，最低检测浓度为5ng/mL(以信噪比≥3计)。
2.2　回收率试验　取肝素抗凝的血浆1mL，精密加入不同浓度的洛伐他汀工作溶液，使其血浆中终浓度分别为10、100、500ng/mL，按“血浆样品制备”项下操作，计算回收率。结果见表1。
2.3　精密度试验　取肝素抗凝的血浆1mL，精密加入不同浓度的洛伐他汀工作溶液，使血浆中终浓度分别为10、100、500ng/mL，按“血浆样品的制备”项下操作，测定日内和日间变异。结果见表1。

表1　洛伐他汀的方法回收率及
日内、日间变异(n=5)

浓度
(ng/mL)

回收率
(%)

日内

日间

测得值
(ng/mL)

RSD
(%)

测得值
(ng/mL)

RSD
(%)

10

97.71

9.77

4.53

9.65

5.65

100

84.25

84.25

5.72

85.06

5.40

500

95.34

476.71

4.26

475.74

6.76

2.4　应用　将本方法应用于5名健康受试者，单剂量口服100mg洛伐他汀胶囊，于0、0.5、1、2、3、4、6、8、12h静脉采血3mL，按本法测定，血药浓度—时间数据经MCPKP药代动力学程序处理，主要药动学参数为：T_max=(2.76±0.28)h；C_max=(71.52±16.9)ng*mL^-1；T_1/2=(1.87±0.29)h，AUC=(429±85.85)ng*h*mL^-1。

3　讨论
按文献方法配制的流动相pH值偏低(pH2.7)，对色谱柱寿命有影响，反相色谱柱合适的pH范围为3.5～6.5，将缓冲液pH调至3.7，同时，改变乙腈和缓冲液的比例，得到满意的色谱分离效果，t_R为5min左右，峰形好，与其它峰达到基线分离。见图1。

图1　洛伐他汀色谱图
A.空白血浆　B.服药后2h血浆
1.洛伐他汀

　　洛伐他汀的最大吸收波长为238nm，在此波长处，分析纯乙腈背景吸收较大，基线噪音干扰低浓度样品的检测，选用色谱纯乙腈结果满意。
柱温对洛伐他汀的色谱分离影响较大，常温(20℃)时，洛伐他汀与干扰峰分离不好，随着温度的升高，分离效果趋好，50℃时达到最佳分离效果。

参考文献

1　　Ling-xiang Zhou,et al.Pharmacokinetic interaction between insradipine and Lovastatin in normal,female and male volunteers,J Pharmacol Experime Therap,1995,273:121
2　　R J Stubbs,et al.Determination of mevinolin and mevinolinic acid in plasma and bile by reversed-phase high-performance liquid chromatography.J Chromatogr,1986,383:438

(本文于1997年4月9日收到)

RP-HPLC Determination of Lovastatin in Plasma

Sun Kaoxiang,Wu Linhua,Hu Junru,Huang Haiyan,Tian Huikai and Fan Hongwei

(Institute of Clinical Pharmacy and Pharmacology,Ha’erbin Medical University,150086)

　　Abstract:A HPLC method is described for the quantitative determination of lovastatin in plasma.The analytical column was parked with Nova-Pak C₁₈ column(5μm,3.9mm×150mm) and kept at 50℃.The mobile phase consisted of a mixture of acetonitrile:aqueous ammonium phosphate buffer(0.05mol/mL,pH7.2)(48∶55,V/V).The detection wavelength was 238nm.Lovastatin in plasma was extracted with SPE solid column.The calibration curve was linear within the range of 5～500ng/mL plasma and the detection limit was 5ng/mL.The mean recovery in samples of 10,50,500ng/mL was (92.43±7.18)% and the RSD for the inter and intra-day were all less than 8%.
　　Key words:HPLC,lovastatin,plasma