一种简易的检测人体血浆中沙丁胺醇浓度的HPLC法

(中山医科大学附属第一医院药学部临床药学研究室　广州　510080)

(中山医科大学临床药理研究所　广州　510089)

　　摘要　　建立了一种简易的反相高效液相色谱方法测定沙丁胺醇血药浓度。以含磷酸二(2-乙基己基)酯的氯仿液进行提取，0.1mol/L盐酸反提，内标为丁酚胺。固定相为Spherisorb C₁₈；流动相为：0.03mol/L磷酸二氢铵(用磷酸调至pH2.6)—甲醇—乙腈(92.2∶3.4∶4.4)，流速1.5mL/min。荧光检测器的激发波长为225nm，荧光波长为310nm。在血浆浓度0.5～50ng/mL范围内线性良好。回收率为78.3％～83.6％。日内相对标准偏差为4.5％～6.8％，日间相对标准偏差为7.2％～9.5％。应用本方法测定了8名志愿者口服沙丁胺醇片后的血药浓度。
关键词：沙丁胺醇　高效液相色谱法　药代动力学

　　沙丁胺醇(Salbutamol)为选择性β-受体激动剂，有较强的支气管扩张作用，临床用于治疗支气管哮喘症。该药血药浓度很低，分析方法的灵敏度要求高，报道有气-质联用法^［1］和高效液相色谱法^［2～9］等。本文报道一种以磷酸二(2-乙基己基)酯加入氯仿进行液—液提取、0.1 mol/L盐酸反提和荧光检测器检测沙丁胺醇血药浓度的简易HPLC，该法具有灵敏度高、方法简便、试剂价廉易得的优点。应用本法测定了8名健康志愿者口服8mg沙丁胺醇片后血药浓度。
1　仪器与试药
1.1　仪器　Waters 510泵，Waters 474型扫描荧光检测器，岛津CR—3A数据处理器，超纯水系统(Milli-Qplus)。
1.2　试剂　甲醇、乙腈均为色谱纯(浙江黄岩化学实验厂)，水为超纯水，磷酸二氢铵为分析纯。
1.3　药品　沙丁胺醇对照品(由广州市医药工业研究所提供，含量99.4%)，丁酚胺(Bamethane,Sigma公司,Lot:65F0535)，磷酸二(2-乙基己基)酯(Di-(2-ethylhexyl)phosphate,DEHP,Sigma公司,Lot:64H0289)，沙丁胺醇片(Ventolin,葛兰素,lot:W2484MB)。
2　实验方法
2.1　标准液的配制　精密称取沙丁胺醇对照品0.0100g，用0.1 mol/L盐酸溶解后移入100mL容量瓶中，稀释至刻度，使其成为0.1mg/mL的标准贮备液。同法配制0.1mg/mL内标贮备液。取沙丁胺醇贮备液200μL移入100mL容量瓶,用超纯水稀释至刻度, 配制成200ng/mL的对照溶液；取400μL内标贮备液配制内标工作液400ng/mL。
2.2　色谱条件　色谱柱：Spherisorb C₁₈4.6mm×150mm,5μm(中科院大连化学物理所) ，柱温28℃。流动相：0.03 mol/L磷酸二氢铵缓冲液(用磷酸调至pH2.6)—甲醇—乙腈 (92.2∶3.4∶4.4)，使用前以0.45μm滤膜过滤，超声波脱气，流速1.5 mL/min。检测器激发波长为225nm，荧光波长为310nm。
2.3　样品处理　于10mL具塞离心管中准确移入血浆1mL及内标溶液50μL混匀，加入含0.12mol/L DEHP的氯仿溶液5mL，涡旋2min，离心10min(4000r/min)，弃掉水及脂化层，取下层氯仿液移入10mL离心管，加入0.1mol/L盐酸0.3mL反提，涡旋1min，离心10min(4000r/min)，取上层酸水层100μL进样测定。
3　实验结果
3.1　色谱行为　沙丁胺醇及内标的色谱峰保留时间分别约为4.9 min和10.2 min，无内源性杂峰干扰(图1)。

图1　高效液相色谱图
A.空白血浆　B.标准品血浆　C.志愿者服药后血浆
1.沙丁胺醇　2.丁酚胺(内标)

3.2　标准曲线的制备　于空白血浆中加入沙丁胺醇对照溶液，使其浓度分别为0.5、1、2、5、10、20、30、40、50ng/mL，按上述“样品处理”项处理，进行测定。以沙丁胺醇浓度(C)为横坐标，沙丁胺醇与内标色谱峰高比值(H)为纵坐标作回归计算。结果表明，在0.5～50ng/mL范围内线性良好，回归方程及相关系数分别为：
H＝-0.00036＋0.087C　r=0.999
3.3　最低检测限测定　当信噪比(S/N)=3时，沙丁胺醇的最低检测限为0.15ng/mL。
3.4　回收率实验　各取空白血浆1mL，分别加入沙丁胺醇对照溶液，配制成30、10、1ng/mL浓度的标准血浆各5批(n=5)，按“样品处理”项操作测定，与相同浓度的对照液直接进样比较，回收率分别为(80.9±3.4)%、(78.3±5.2)%、(83.6±8.0)%。
3.5　精密度实验　对高(30ng/mL)、中(10ng/mL)、低(1ng/mL)3个浓度的血样，同日内处理测定5批，计算日内相对标准偏差；隔3日测定1批，连续5批，算出日间相对标准偏差。日内相对标准偏差为4.5％～6.8％，日间相对标准偏差为7.2％～9.5％。
3.6　方法学应用　8名健康志愿者，经检查心、肝、肾功能正常，试验前1周未服用任何药物，晨起空腹单次口服沙丁胺醇片8mg，分别于服药后0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、10、12 和24h静脉取血约3.5mL, 分离血浆后按“样品处理”项处理测定，计算药动学参数为T_max(1.8±0.7)h,C_max(31.0±7.5)ng/mL,AUC(189.3±31.3)ng^．mL^-1．h,MRT(7.4±0.8)h,平均药时曲线见图2。

图2　8名志愿者单次口服8mg沙丁胺醇片后的药时曲线4　讨论

4.1　提取条件的选择　沙丁胺醇具有两性特征，pKa为9.3和10.3，易溶于水，故多用固相提取^［2～6］。因固相提取法成本较高且繁琐，我们尝试了液－液提取法。用有机溶剂如氯仿提取时回收率为零，如用含0.12mol/L DEHP的氯仿提取，0.1mol/L盐酸反提，可得回收率约80%，这与文献报道^［7～9］相似。
4.2　流动相的选择　考察了几种流动相组成对样品保留时间的影响情况。有文献报道^［7,8］用水和乙腈(92∶8)作流动相, 而我们用此流动相后，样品和内标峰保留时间太长，峰形变钝。增加乙腈比例或另加入甲醇，保留时间大大提前，但沙丁胺醇和内标峰均有杂峰干扰。我们也试用过在水和乙腈中加少量四氢呋喃或三乙胺，保留时间太短，样品峰亦有干扰。加0.03mol/L磷酸二氢铵入流动相后, 保留时间适当，分离完全。据报道^［4］，肝素易干扰沙丁胺醇色谱峰，而在我们的条件下无干扰，血样本可用肝素抗凝。
4.3　温度对分离的影响　室内温度变化对沙丁胺醇和内标保留时间影响较大，因此，柱恒温是必要的。

参考文献

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(本文于1997年3月10日收到)

A Simple and Rapid HPLC Determination of Salbutamol
Concentrations in Human Plasma with Fluorescence Detection

Chen Xiao
(Department of Pharmacology,the First Affiliated Hospital,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou,510080)

Zhao Xianglan
(Institute of Clinical Pharmacology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou,510089)

　　Abstract:A simple and rapid HPLC method is presented for the determination of salbutamol in human plasma.Plasma samples were extracted with chloroform containing di(2-ethylhexyl)phosphate.Samples were back extracted into a hydrochloric acid solution.This method involved a C₁₈ column as stationary phase and 0.03mol/L (NH₄)H₂PO₄(pH2.6,adjusted by H₃PO₄)-methanol-acetonitrile(92.2:3.4:4.4)as mobile phase.A fluorescence detector was used for this assay.Bamethane was used as the internal standard.The carlibration curve was linear between 0.5 and 50 ng/mL with a regression coefficient of 0.999. The recoveries of salbutamol samples were 78.3%～83.6% for plasma. Inter-day and intra-day RSD were 4.5%～6.8% and 7.2%～9.5% respectively. This method has been used in the bioavailability study of salbutamol tablets (Ventolin, Glaxo) given to eight healthy volunteers.
　　Key words:salbutamol,HPLC,pharmacokinetics