高效液相色谱法测定人血浆中尼麦角林体内代谢物10α-甲氧基-9，10-二氢麦角醇的浓度

(中国药科大学分析化学教研室　南京　210009)

(中国药科大学制药有限公司　南京　210009)

　　摘要　　采用高效液相色谱法测定人血浆中10α-甲氧基-9，10-二氢麦角醇(MDL，尼麦角林体内代谢物)的浓度。MDL和麦角新碱(内标)用氯仿从血浆中提取，并在Sphersorb C₁₈柱上，以乙腈—0.1mol/L(pH5)醋酸铵(1∶4)为流动相进行分离，在225nm处检测。本法简便、灵敏、专属性好。
关键词：10α-甲氧基-9，10-二氢麦角醇　尼麦角林　高效液相色谱法　血药浓度

　　尼麦角林(Nicergoline,10α-methoxy-1，6-dimethylergoline-8β-methanol-5-bromonicotinic acid ester,商品名脑通)为麦角碱类半合成品，临床上用于改善血液循环和脑代谢功能。本品经口服后体内迅速代谢，并以3种代谢物存在(见图1)。Banno等^［1］采用HPLC—MS检测尼麦角林及其代谢物的血浆中的浓度，其中10α-甲氧基-9，10-二氢麦角醇(MDL)的浓度最大。国外文献报道，HPLC法测定MDL血浆浓度的检测手段有质谱法^［1，2］、紫外法^［3］和荧光法^［4］。本文建立了灵敏、简便的测定MDL的方法，并将MDL作为标志物用于尼麦角林的制剂生物利用度研究。

图1　尼麦角林及代谢物结构和代谢途径

1　仪器与药品
　　美国HP高效液相色谱仪：1050高压泵，VWD紫外检测器，HP2D Chemstation。
10α-甲氧基-9，10-二氢麦角醇，又名10α-甲氧基-6-甲基麦角林-8β-甲醇(10α-methoxy-9，10-dihydrolysergol,10α-methoxy-6-methylergoline-8β-methanol，MDL)，1-羟甲基-10α-甲氧基-6-甲基麦角林-8β-甲醇(1-hydroxymethyl-10α-methoxy-6-methylergoline-8β-methanol，1-OHMMDL)和10α-甲氧基-6-甲基麦角林-8β-甲醇(10α-methoxy-6-methylergoline-8β-methanol,1-MMDL)对照品(97%)由意大利爱宝大药厂提供，麦角新碱(内标)和尼麦角林对照品(99%)由海南金晓制药厂提供。乙腈为光谱纯，水为二次重蒸馏水，其它试剂为分析纯。
2　色谱条件
色谱柱：Spherisorb C₁₈ 5μ 4.6mm×150mm(中科院大连化物所)；流动相：乙腈—0.1mol/L(pH5)醋酸铵(1∶4)；流速：1mL/min，检测波长：225nm。
3　血样处理
取血浆样品1mL置10mL具塞离心管中，加内标麦角新碱甲醇液(5μg/mL)20μL，加0.5mol/L氢氧化钠试液0.5mL，混匀，加氯仿5mL，混旋提取5min后，4000r/min离心10min，取有机相置于另一离心管中，于40℃水浴中氮气流下挥发溶剂，残渣用80μL流动相溶解，离心，取上清液20μL进样，记录色谱图(见图2)。

图2　色谱图
A.代谢物及内标　B.空白血浆　C.样本血浆
1.1-OHMMDL　2.内标　3.MDL　4.1-MMDL

4　线性关系
分别精密吸取MDL甲醇液(1μg/mL)适量置10mL具塞离心管中，加入人空白血浆1mL，混匀，配制成每1mL含MDL 5、10、25、50、75和100ng的标准系列，加内标麦角新碱甲醇液(5μg/mL)20μL后，按“血样处理”项下操作(n=5)，以MDL的浓度(Y)对MDL与内标的平均峰高比(X)进行回归计算，得回归方程：
Y＝-1.14+75.4X　r＝0.999
5　回收率及精密度
取MDL甲醇液(1μg/mL)10、50和100μL，各加麦角新碱甲醇液(5μg/mL)20μL，氮气流下吹去溶剂，加流动相80μL溶解，制得含MDL 10、50和100ng的对照品液，取20μL进样，计算峰高比。另取空白血浆加MDL甲醇液(1μg/mL)适量，配制成每1mL含MDL 10、50和100ng的试样，经“血样处理”项下操作后，进行日内和日间测定，计算峰高比，并通过上述对照品液的峰高比，计算回收率和精密度，结果见表1。

表1　回收率和日内、日间精密度试验(n=5)

配制浓度
(ng/mL)

日内

日间

回收率
(%)

RSD
(%)

回收率
(%)

RSD
(%)

10

97.0

3.3

105.0

9.5

50

86.8

6.1

89.2

3.4

100

81.8

3.0

80.2

6.4

6　检测限
　　当信噪比为4时，本法的最低检测浓度为5ng/mL。
7　受试者血样浓度的测定
10位健康受试者空腹服用尼麦角林片(10mg/片)3片，于服药后0.5～24h定时静脉取血，分离出血浆，取血浆1mL，按“血样处理”项下操作。10位受试者平均血药浓度—时间曲线见图3。

图3　10位受试者平均血药浓度—时间曲线图

8　讨论
　　将尼麦角林以其代谢物与内标物达到完好的分离是测定MDL浓度的关键。Banno^［1,2］采用梯度洗脱的方式分离和检测原药及代谢物。根据本试验的要求和特点，我们选用不同比例分离系统，当乙腈与0.1mol/L醋酸铵为1∶1时，原药与代谢物已经完全分离；当乙腈与0.1mol/L醋酸铵为1∶2时，尼麦角林的保留时间已达44min；两者比例为1∶3时，尼麦角林已经不出峰。为消除血浆中内源性物质的干扰，又能使内标与代谢物完全分离和利于MDL的快速测定，将乙腈与0.1mol/L醋酸铵的比例定为1∶4。经10位受试者的血样测定，分离状况良好。
经摸索，氯仿作为提取溶剂与醋酸乙酯、乙醚、苯相比较，具有干扰物少、回收率高等特点。
总之，本法灵敏、简便、重现性好和良好线性关系，符合血药浓度的测定要求，为尼麦角林制剂的生物利用度研究提供了可靠的方法。

参考文献

1　Banno K,et al.Assay of nicergoline and three metabolites in human plasma and urine by high-performance liquid chromatography-atmospheric pressure ionization mass spectrometry.J Chromatogr,1991,568:375
2　Banno K,et al.Separation and quantitation of nicergoline and related substances by high-performance liquid chromatography-atmospheric pressure ionization mass spectrometry.Chromatographia,1991,31:50
3　Sioufi A,et al.Determination of 10α-methoxy-9，10-dihydrolysergol,a nicergoline metabolite,in human urine by high performance liquid chromatography.Biomedical Chromatography,1992,6:9
4　Nieder M,et al.Selective and sensitive quantification of nicergoline and metabolites in biological fluids by HPLC and its application to pharmacokinetic research in humans.Z.Naturforsch,B:Anorg Chem Org Chem,1987,42(9):1187

(本文于1997年5月29日收到)

Determination of 10α-Methoxy-9，10-dihydrolysergol
(a Nicergoline Metabolite)in Human Plasma by HPLC

Yu Jian
(Department of Analytical Chemistry,China Pharmaceutical University,Nanjing,210009)

Du Chunbo
(Pharmaceutical Company,China Pharmaceutical University,Nanjing,210009)

　　Abstract:A method for the determination of 10α-methoxy-9，10-dihydrolysergol(MDL),a nicergoline metabolite,in human plasma has been developed using HPLC.MDL and ergometrine as internal standard were extracted from the plasma with chloroform and separated on a reversed-phase ODS column with a mobile phase of acetonitrile-0.1mol/L(pH5)ammonium acetate(1∶4).The eluate was detected at 225nm,the method is simple,sensitive and specific.
　　Key words:10α-methoxy-9，10-dihydrolysergol(MDL),nicergoline metabolite,HPLC,drug concentration in plasma