高效液相色谱法测定血浆中诺氟沙星

(大庆油田总医院　163001)

　　摘要　　采用反相高效液相色谱法，以0.1 %磷酸水溶液—乙腈—三乙胺(435∶65∶0.2)为流动相，以水杨酸为内标，测定血浆中诺氟沙星的浓度。该方法可使诺氟沙星、内标物以及血浆成分间达到良好分离。该方法操作简便、重现性好，平均回收率达到97.9 %，最小检测浓度为50 ng/mL。
关键词：诺氟沙星　高效液相色谱　血药浓度

　　诺氟沙星为第三代氟喹诺酮类药物。有关体液中诺氟沙星浓度测定的高效液相色谱法见有关文献^［1～4］。诺氟沙星理化性质较为特殊，要求流动相的pH较低，难于寻找合适的内标物。发表的方法均为外标法，给测定结果带来较大误差。本文使用水杨酸作为内标物，测定血浆中诺氟沙星的浓度，取得较为满意的结果。
1　药品与试剂
诺氟沙星对照品(98.9 %，锦州制药一厂)；水杨酸对照品(99.6 %，山东新华药厂)；乙腈：HPLC级，甲醇：分析纯。
诺氟沙星对照溶液：精密称取诺氟沙星对照品25 mg，置于25 mL容量瓶中，加1 mL稀醋酸使溶解，用甲醇稀释至刻度，并制成浓度为0.5 mg/mL和0.05 mg/mL的工作溶液，置冰箱中备用。
水杨酸内标溶液：精密称取水杨酸对照品50 mg置于50 mL容量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，置冰箱中备用。
2　仪器与色谱条件
SP 8810型液相色谱仪，Spectra 100紫外检测器，SP 4200积分仪。色谱柱：μ-Bondapak C₁₈柱(3.9 mm×300 mm)10 μm；流动相：0.1 %磷酸水溶液—乙腈—三乙胺(435∶65∶0.2)；流速：2.0 mL/min；检测波长：UV 278 nm；进样量：10 μL。
3　标准曲线的制备
取血浆7份，每份0.5 mL，置于离心管中，依次加入诺氟沙星对照溶液，使血药浓度分别为0.1、0.3、0.5、1、3、5及10 μg/mL。每管中加入水杨酸内标溶液各20 μL，振摇混匀。每管中各加甲醇1.0 mL，旋摇1 min，3000 r/min离心10 min，分别取上清液作为对照液，进样10 μL。以诺氟沙星与水杨酸峰面积比值Y对诺氟沙星浓度X进行线性回归，回归方程为：
Y＝0.9584X-0.0497　r＝0.9996
4　样品处理
精密量取血浆0.5 mL，加入水杨酸内标溶液20 μL，用旋转振荡器振荡使混匀，加入甲醇1.0 mL，旋摇1 min后，3000 r/min离心10 min，分别取上清液作为供试液，进样10 μL。
5　精密度
取血浆0.5 mL，分别加入诺氟沙星对照溶液，使血药浓度分别为0.5、1.0及5.0 μg/mL，每个浓度制备平行样品各5管。以下处理同标准曲线制备。日内试验，3个浓度的样品在同一天内进样，计算日内差异。日间试验，每天重新配制3个浓度的供试样品，连续测定5d，计算日间差异。
6　回收率
6.1　样品回收率　配制浓度为1.0 μg/mL和5.0 μg/mL的诺氟沙星甲醇溶液各5管，分别加入内标溶液各20 μL，使总体积为1.5 mL，进样，1.0 μg/mL和5.0 μg/mL样品的平均回收率分别为(100.8±2.0)%和(100.5±2.5)%。
6.2　提取回收率　以含药血清提取后测得的诺氟沙星峰面积与诺氟沙星甲醇溶液直接进样测得的峰面积之比计算提取回收率。血药浓度为1.0 μg/mL和5.0 μg/mL时，5个平行样品的平均回收率分别为(98.6±2.4)%和(97.2±1.8)%。
7　实验结果
7.1　血浆样品中诺氟沙星的分离　见图1，空白血浆提取后的色谱峰对诺氟沙星和内标物的测定无干扰。诺氟沙星与内标物的保留时间分别为10.76、7.61 min，两者的分离度R＝6.3。

图1　空白血浆(A)和含药血浆(B)色谱图
1.水杨酸(7.61 min)　2.诺氟沙星(10.76 min)

7.2　精密度　血浆样品中诺氟沙星浓度的测定见表1。

表1　诺氟沙星日内和日间测定的重现性
(RSD，%，n=5)

浓度/(μg/mL)

日内

日间

0.5

3.2

6.2

1

2.7

5.8

5

2.5

5.1

7.3　样品测定　3只狗口服诺氟沙星12 mg/kg，于服药后0、0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、12、24及36 h抽取血样，测得狗口服诺氟沙星后的动力学参数见表2。

表2　狗口服诺氟沙星的动力学参数

药物

诺氟沙星

C_max/(mg/L)

2.2±0.4

T_max/h

1.6±0.2

T_1/2/h

4.3±0.3

AUC_0～∞/(mg/L*h)

19±3

8　讨论
8.1　流动相中三乙胺浓度是决定诺氟沙星和内标物良好分离的关键，对诺氟沙星的峰形以及诺氟沙星与内标物的分离度均有影响。三乙胺浓度降低，诺氟沙星峰形增宽；三乙胺浓度升高，诺氟沙星峰形变锐，但两者分离度减小，最终相互重叠。本文确定的浓度可使血浆成分、诺氟沙星和内标物达到良好的分离。
8.2　采用甲醇直接沉淀血浆中蛋白质成分，不经浓缩直接进样，最小检测浓度可达50 ng/mL，基本可以满足临床研究工作的需要。如果选用荧光检测器可以进一步提高灵敏度。该方法操作简便，回收率较高。
8.3　选用水杨酸做内标物，两者的分离度较大，不影响诺氟沙星的浓度测定，大大地提高了方法的准确性。

参考文献
1　Boppana V K,et al.Determination of norfloxacin,a new nalidixic acid analog in human serum and urine by HPLC.Antimicrob Agent Chemother,1982,21:808
2　Lagana A,et al.High performance liquid chromatographic determination of norfloxacin in human tissue and plasma with fluorescence detection.J Chromatogr,1987,417:135
3　Nilsson E I.Assay of ciprofloxacin and norfloxacin in serum and urine by HPLC.J Chromatogr,1987,416:207
4　许丹科等.反相离子对色谱法测定人血中氟哌酸.药物分析杂志，1990，10(6)：265

(本文于1997年6月23日收到)

Determination of Norfloxacin in Plasma by HPLC

Li Bingyang,Wang Cheng,Song Tiebing,Li Shifeng,Xu Lianqin,Zhang Yunzhe and An Tongtong

(Daqing Oil Field Hospital General,163001)

　　Abstract:A rapid specific and sensitive HPLC method for the determination of norfloxacin in plasma was developed.The mobile phase was 0.1 % phosphoric acid-acetonitrile-triethylamine(435∶65∶0.2).The plasma sample was prepared with methanol after addition of salicylic acid as the internal standard.Detection wavelength was 278 nm.The lowest detectable concentration of norfloxacin was 50 μg/L.The average recovery was 97.9 %.The method can be used in TDM.
　　Key words:norfloxacin,HPLC,plasma level