人血浆中氧氟沙星的HPLC测定及药代动力学研究

(华西医科大学药学院　成都　610041)

　　摘要　　报道了测定人血浆中氧氟沙星浓度的反相高效液相色谱法。采用μ Bondapak C₁₈色谱柱，甲醇—0.025 mol/L磷酸二氢钾(42∶58，pH 2.5)为流动相，295 nm为检测波长，非那西丁为内标，样品用甲醇沉淀蛋白，经0.45 μm滤膜过滤后富集进样。该法灵敏、简便、准确，氧氟沙星在0.25～10 μg/mL浓度范围内线性关系良好(r＝0.9997)，检测限为0.15 μg/mL(S/N=3∶1)，平均回收率为101.1 %，不同浓度水平的日内和日间精密度测定结果RSD均小于10 %。采用该法对8名健康受试者口服氧氟沙星片后的药代动力学和生物利用度进行了研究。
关键词：氧氟沙星　血浆　高效液相色谱法　药代动力学　生物利用度

　　氧氟沙星(氟嗪酸，Ofloxacin,OFLX)是目前广泛应用于临床的第三代喹诺酮类药物，主要用于治疗呼吸道、泌尿道、肠道、皮肤、关节及软组织等多种系统的感染，具有抗菌谱广、作用强，与多种抗菌药物间无交叉耐药性的特点。对OFLX在人体内血药浓度的测定，目前国内外文献报道一般采用HPLC—荧光检测法或生物分析法^［1～3］。本文参考有关文献^［4，5］并加以改进，建立了灵敏度较高、线性良好、操作简便的HPLC—紫外检测法，并以康利必妥片为参比制剂，对氧氟沙星片在正常人体内的药代动力学及生物利用度进行了研究。
1　仪器与试药
日本岛津LC—3A型高效液相色谱仪，SPD—1型紫外检测器，C—R1A型色谱数据处理机；LD 42型离心机(北京医用离心机厂)；YKH—Ⅱ型液体快速混合器(江西医疗器械厂)；H6605型超声清洗器(无锡超声电子设备厂)；Topcon-386计算机，3P87药物动力学程序(中国药理学会编)。
氧氟沙星对照品：成都制药二厂提供，纯度99.60 %；氧氟沙星片剂：四川长征制药厂产，批号：960201；康利必妥片剂：广东珠海药业集团产，批号951003；非那西丁标准品：中国药品生物制品检定所。其余试剂均为分析纯。
氧氟沙星标准溶液：精密称取OFLX对照品适量，以甲醇为溶剂配成100 μg/mL的标准贮备液，于冰箱内4 ℃保存，用时以甲醇稀释成不同浓度的标准溶液。
内标溶液：精密称取非那西丁适量，以甲醇为溶剂配成1 mg/mL的内标溶液，于冰箱内4 ℃保存。
2　色谱条件
μ Bondapak C₁₈色谱柱(250 mm×4.6 mm，10 μm)；流动相：甲醇—0.025 mol/L磷酸二氢钾(42∶58，磷酸调pH至2.5)；流速：1 mL/min；检测波长：295 nm，温度：室温。
3　样品处理
精取血浆样品0.5 mL，置5 mL具塞离心试管中，加入内标溶液50 μL(内含非那西丁50 μg)，甲醇1.5 mL，混旋10 min，离心(3000 r/min)10 min。取上清液经0.45 μm滤膜过滤后，置75～80 ℃水浴上通空气流挥干。残渣用100 μL甲醇溶解，混旋10 min，离心(3000 r/min)10 min。吸取上清液20 μL在上述色谱条件下分离测定。记录色谱图，量取OFLX峰面积与内标峰面积。图1为含有内标的血浆样品和空白血浆样品色谱图。

图1　血浆样品色谱图
A.空白血浆提取物　B.含药物血浆提取物
1.氧氟沙星(OFLX)　2.非那西丁(IS)

4　线性关系考察
分别精取空白血浆0.5 mL，置7支5 mL具塞离心试管中，分别加入不同浓度的OFLX标准溶液100 μL，使每管含OFLX分别为0.25、0.5、1.0、2.0、5.0、8.0和10.0 μg/mL，然后按“样品处理”方法，从“加入内标溶液50 μL……”起，对样品进行处理和色谱分析，以OFLX峰面积与内标峰面积之比(Y)对OFLX浓度(X)进行线性回归，得回归方程：
Y＝-0.041+0.353X　r＝0.9997
血浆中OFLX的检测限为0.15 μg/mL(S/N=3∶1)。
5　回收试验
分别于0.5 mL空白血浆中加入高、中、低浓度的OFLX标准溶液100 μL，依法测定回收率，结果见表1。

表1　回收试验结果(n=5)

加入量/
(μg/mL)

测得量/
(μg/mL)

回收率/%

RSD/%

1.0

1.16

101.6

4.01

5.0

4.98

99.6

5.98

10.0

10.22

102.2

5.95

6　精密度试验
分别于高、中、低3种血药浓度水平同法进行日内与日间(10 d内)精密度考察，结果见表2。

表2　精密度试验结果

浓度/
(μg/mL)

日内(n=5)
RSD/%

日间(n=6)
RSD/%

1.0

4.01

5.46

5.0

5.98

8.30

10.0

5.95

5.74

7　人体血药浓度测定
健康志愿者8名，随机交叉口服OFLX片剂(400 mg)和康利必妥片剂(400 mg)后，于24 h内在11个时间点静脉取血，同法测定各血样中OFLX的浓度。所得结果经3P87药动学程序处理，采用非室模型以统计矩及血药浓度经时数据求出有关药动学参数，并以康利必妥片为标准参比制剂，计算单剂量口服OFLX片剂的相对生物利用度F，结果见表3。均值的药时曲线见图2。

表3　口服OFLX片与康利必妥片
的药动学参数(n=8)

药物

AUC/
(h*μg/mL)

t_max/
h

C_max/
(μg/mL)

F±SD/
%

OFLX

46.76

1.50

6.43

103.8±18.17

康利必妥

45.08

1.47

6.26

图2　口服OFLX片及康利必妥片(400 mg)后的
血药浓度—时间曲线(n=8)
——.OFLX　---.康利必妥

8　结果与讨论
8.1　口服单剂量OFLX片剂(400 mg)，达峰时间t_max为1.5 h，峰浓度为6.43 μg/mL，相对生物利用度F为103.8 %±18.17，与文献报道基本相近^［7，8］。统计学处理表明，其C_max与参比制剂无显著性差异(P＞0.05)，AUC、t_max与参比制剂有显著性差异(P＜0.05)，提示OFLX片剂的生物利用度略高于康利必妥片剂。
8.2　由于OFLX的水溶性较其他喹诺酮类药物高10倍以上，故无法用常规的有机溶剂提取法提取血浆药物。本实验采用甲醇沉淀血浆蛋白并提取药物，需要解决两个问题：一是血浆中水溶性杂质的干扰。对此，国内文献报道的流动相组成中普遍使用了四丁基溴化铵，其通过与药物形成离子对来延长OFLX的保留时间，使之与血浆杂质峰分离，或者使用荧光检测器进行检测来消除干扰。本实验采用酸性的甲醇—磷酸盐混合流动相，通过控制适当的比例，使OFLX的理论板数不低于2600，从而使血浆杂质峰与OFLX峰实现良好分离(分离度R≈1.5，见图1)。这样既避免使用昂贵的离子对试剂，又能用紫外检测器进行检测；二是未沉淀完全的血浆蛋白污染柱子、降低柱寿命的问题。本实验将沉淀蛋白后的上清液用0.45 μm滤膜过滤后再富集，即可得到澄清的测定液。本实验共测血样300余个，柱压与柱效基本保持不变。

*华西医大药学院92级学生

参考文献
1　李　珍等.高效液相色谱法测定血清中氧氟沙星的浓度.第二军医大学学报，1994，15(2)：183
2　Lecoguie A,et al.Determination of ofloxacin in plasma and urine by liquid chromatography.J Chromatogr,1988,434:320
3　郭洪斌等.反射离子对高效液相色谱荧光检测法测定人血中氟嗪酸.佳木斯医学院学报，1994，17(1)：32
4　尹一子等.HPLC测定血清中氧氟沙星的浓度.白求恩医科大学学报，1994，20(6)：627
5　徐子硕等.氧氟沙星片剂的HPLC测定.中国医药工业杂志，1994，25(11)：516
6　卓海通等.国产氧氟沙星在健康成人中的药物动力学和生物利用度研究.中国医院药学杂志，1993，13(7)：293
7　仇益群等.氧氟沙星片的药物动力学和生物利用度.新药与临床，1994，13(4)：224

(本文于1997年2月24日收到)

Determination and Pharmacokinetics Study of

Ofloxacin in Human Plasma by HPLC

Zhang Dan,Zeng Jingze,Bianba-Cangjue and Jiang Xuehua

(School of Pharmacy,West China University of Medical Sciences,Chengdu,610041)

　　Abstract:This paper reports a sensitive,simple and accurate RP-HPLC method for the determination of ofloxacin(OFLX)in human plasma.Using a μ-Bondapak C₁₈ column(25 cm×4.6 mm,10 μm)under room temp,the mobile phase consisted of methanol—0.025 mol/L KH₂PO₄(42∶58，pH 2.5)and the flow rate was 1.0 mL/min.The UV detection wavelength was 295 nm.Using phenacetin as internal standard and deproteined by adding 1.5 mL methanol.The precipitated mixture was shaken and then centrifuged at 3000 r/min for 10 min,after filtration by 0.45 μm filter membrane,the filtration was evaporated to dryness.The residue was dissolved in 0.1 mL methanol and 20 μL of the soln.was injected into the system.Within 0.25～10 μg/mL,OFLX had a good linearity(r＝0.9997).The detection limit was 0.15 μg/mL(S/N=3∶1)and the mean recovery of OFLX was 101.1 %.The within-day and day-to-day precision expressed by RSD was less than 10 % at three drug levels.
This method has been used to investigate pharmacokinetics and bioavailability of OFLX in eight healthy human volunteers.
　　Key words:ofloxacin,plasma,HPLC,pharmacokinetics,bioavailability