固相萃取反向冲洗—反相HPLC法测定血浆中醋氯芬酸浓度

(中国药科大学　南京　210009)

　　摘要　　建立了反相HPLC法，测定血浆中醋氯芬酸的浓度，并对单剂量口服给药后的药代动力学进行了初步的探讨。血浆样本经大孔树脂小柱萃取后，以ODS柱分析，流动相为甲醇—水—冰醋酸(62∶36∶2)，检测波长为275 nm。在0.5～100 μg/mL浓度范围内线性关系良好，最低检出限为0.3 μg/mL。
关键词：固相萃取　反向冲洗　反相HPLC　醋氯芬酸　大孔树脂　药代动力学
醋氯芬酸(Aceclofenac)，化学名［邻-(2，6-二氯苯胺)苯］乙酰乙酸，为一种新的灭酸类非甾体抗炎药，实验证明，该药物比双氯芬酸、酮基布洛芬、吲哚美辛等更加安全有效^［1～3］，临床上用于治疗类风湿性关节炎和术后镇痛等。目前，国内外未见其血药浓度分析方法的报道。本实验采用大孔树脂小柱萃取，反向冲洗的方法净化血浆样本，建立了快速、准确的反相HPLC法，测定了血浆中醋氯芬酸的浓度，并对单剂量口服给药后的药代动力学进行了初步研究。

1　仪器及试药
1.1　仪器　HP 1050高效液相色谱系列：19852A泵系统，79854A多波长检测，HP 3396A数据处理机。PT—系列萃取柱(河北津杨滤材厂)。
1.2　试药　醋氯芬酸对照品(含量为99.83 %)及片剂(本校药剂教研室提供)；内标：对羟基联苯(Sigma公司产品)；肝素钠(华美生物工程公司)；甲醇(上海振兴化工一厂，AR)；冰醋酸(南京化学试剂厂，AR)；重蒸水(实验室采用全玻璃仪器自制)。
2　色谱条件
　　色谱柱为Spherisorb C₁₈，5μm，150mm×4.0mm(大连化物所)；保护柱为Precolumn Filter(Upchurch Scientific,Inc.)；流动相为甲醇—水—冰醋酸(62∶36∶2)；流速1.0 mL/min；检测波长275 nm；数据处理机衰减3；纸速0.2cm/min。
3　正交设计法优选萃取条件
影响萃取条件的因素主要有缓冲液的pH，洗脱溶剂及洗脱溶剂的体积等，因此，设计三因素四水平的正交试验(见表1)，以确定最佳萃取条件。其中因素A为pH水平，B为洗脱溶剂甲醇—冰醋酸比例，C为洗脱溶剂的体积(mL)。按L₁₆(4⁵)表随机安排实验，由实验结果确定最佳萃取条件为pH 7.0，即以水为缓冲体系，以甲醇4 mL为洗脱溶剂，反方向洗脱。

表1　因素和水平

水平

因素

A

B

C

1

1.0

100∶0

2.0

2

3.0

98∶2

3.0

3

5.0

95∶5

4.0

4

7.0

92∶8

5.0

4　血浆样本的制备
　　用甲醇2 mL，水5 mL依次通过小柱进行活化，顺序加入血浆样本1 mL及10 μg/mL的内标工作液(取内标物质适量，精密称定，加甲醇溶解，并稀释成10 μg/mL的工作液)0.2 mL，以水5 mL冲洗杂质，继以甲醇4 mL反方向洗脱，收集洗脱液，于60 ℃水浴吹氮气挥干溶剂，残渣用流动相0.5 mL溶解，取20 μL进样分析。色谱图见图1。

图1　HPLC色谱图
A.空白血浆　B.空白血浆添加内标
C.单剂量口服给药3 h后血浆添加内标
1.醋氯芬酸　2.对羟基联苯

5　标准曲线的制备
　　取健康人血浆，分别向其中加入不同体积的对照品工作液(取对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，并稀释成1000 μg/mL的工作液)，制成0.5、1、5、10、50、100 μg/mL的血浆样品，按“4”项下操作，进样分析，以药物与内标浓度之比为横坐标(X)，药物与内标峰面积之比为纵坐标(Y)作回归分析，得回归方程为：
Y＝-0.05014+1.793X　r＝0.9980　n=6最低检出限为0.3 μg/mL。
6　回收率试验
6.1　萃取回收率　分别配制浓度为0.5、10、100 μg/mL的血浆样品，按“4”项下操作，不加内标，待挥干溶剂后，以内标溶液0.5 mL溶解，进样分析，得药物与内标峰面积比Rc；另以甲醇配制相应浓度为1.0、20、200 μg/mL的对照品溶液，其中所含内标浓度与样品溶液中相同，进样分析，得药物与内标峰面积比R_2c。按回收率(%)＝Rc/R_2c×100%(C为浓度)计算，见表2。
6.2　方法回收率　分别配制浓度为0.5、10、100 μg/mL的血浆样品，按“4”项下处理，进样分析。将药物与内标峰面积比代入标准曲线，求出测定药物浓度，按回收率(%)＝测得量/添加量×100%计算，见表3。

表2　萃取回收率(n=5)

浓度/(μg/mL)

回收率/%

RSD/%

0.5

87.6

3.5

10

92.2

1.2

100

89.4

4.4

表3　方法回收率(n=5)

浓度/(μg/mL)

回收率/%

RSD/%

0.5

94.7

9.0

10

96.8

1.3

100

93.3

2.8

7　精密度试验

　　分别配制浓度为0.5、10、100 μg/mL的血浆样品，进行日内及日间精密度考察，结果见表4。

表4　精密度试验(n=5)

浓度/
(μg/mL)

日内

日间

/
(μg/mL)

RSD/
%

/
(μg/mL)

RSD/
%

0.5

0.4892

7.9

0.5302

9.8

10

9.758

1.6

9.707

2.0

100

95.06

2.3

96.04

3.9

8　醋氯芬酸在正常人体内的血浓经时曲线

　　健康受试者3名，空腹口服醋氯芬酸片(100 mg/片)1片，服药2 h后进标准餐，给药后0.5、1、2、3、4、6、8、12、24 h静脉取血3.0 mL，以肝素钠抗凝，离心分离血浆，按“4”项下处理，进样分析，测得血药浓度C，3名受试者的平均血浓经时曲线见图2。

图2　单剂量口服100 mg醋氯芬酸后
的血药浓度经时曲线

9　讨论
9.1　固相填料的选择　选用C₁₈，硅胶及大孔树脂为填料的小柱，分别对醋氯芬酸血浆样本进行萃取，考察了不同的洗脱条件，硅胶萃取后在色谱图上几乎无响应，C₁₈的萃取回收率仅为30%左右，而大孔树脂的萃取效率可达89.8%，故选择大孔树脂为固相填料。
9.2　洗脱方式的选择　用大孔树脂萃取血浆样本后，经甲醇正向冲洗法所得的色谱图上杂质峰较多，其中在10 min左右有一明显杂质峰，与样本出峰时间重合，用大量的水冲洗(10 mL)也未能冲去，可能杂质略有亲脂性，考虑到以水清洗血浆中的杂质时，是正向进行，大部分杂质已被洗脱，即使有少量未被洗脱，也应该靠近小柱出口，若反方向洗脱，则杂质不易引入。而对于亲脂性强，保留时间较长的样品，在经水清洗之后，仍保留在小柱的入口顶端部分。反向冲洗，可减少洗脱溶剂的用量，还可加速洗脱，提高洗脱效率，洗脱后，消除了杂质的干扰，2种洗脱方式的空白血浆色谱图见图3。

图3　不同洗脱方向的影响
A.正方向洗脱　B.反方向洗脱

9.3　药动学参数　血药浓度的测定结果表明，3名受试者体内血浓经时变化的趋势基本相同，将三者血浓数据的平均值用PKBP—N1程序拟合，该药单剂量口服给药后在体内呈二房室模型，其药动学参数见表5。

表5　单剂量口服给药100 mg后的药动学参数

参数　　　　　

单位

数据

A

μg/mL

95.4637

α

1/h

0.9421

B

μg/mL

0.9189

β

1/h

0.0214

k₂₁

1/h

0.0665

k₁₂

1/h

0.5942

k₁₀

1/h

0.3027

t_1/2(α)

h

0.7358

t_1/2(β)

h

32.4341

Vc

L/kg

5436.1860

参考文献
1　　Gonzalez-Alvaro I,et al.Aceclofenac,a new nonsteroidal antiinflammatory drug,decreases the expression and function of some adhesion molecules on human neutrophils.J Rheumatol,1996,23(4):723
2　　Kornasoff D,et al.The efficacy and tolerability of aceclofenac compared to indomethacin in patients with rheumatoid arthritis.Rheumatol Int,1996,16(6):225
3　　Martin-Mola E,et al.Aceclofenac in comparison to ketoprofen in the treatment of rheumatoid arthristis.Rheumatol Int,1995,15(3):111

(本文于1997年7月3日收到)

Determination of Aceclofenac in Plasma by RP-HPLC

with Solid Phase-Back Flushing Extaction Method

Gao Liqin,Liu Wenying and Xing Jiudong
(China Pharmaceutical University,Nanjing,210009)

　　Abstract:A RP-HPLC method has been developed to determine the concentration of aceclofenac in plasma.After extracted by a macroreticular resin cartridge with back-flushing method,the plasma sample was analysed on an ODS column.The mobile phase is methanol-water-glacial acetic acid(62∶36∶2).The detective wavelength is 275 nm.In the concentration range of 0.5～100 μg/mL,a good linearity can be found.The inter-day and intra-day precision are all less than 10 %.The method was used in the pharmacokinetic study of aceclofenac.The results from three volunteers shew that the drug acted more likely in two compartment model.The plasma concentration got peak value at 3 h after the admininstration.And the t_1/2(β) value of 32.4 h revealed that the elimination speed of the drug is a little bit slow.
　　Key words:RP-HPLC,aceclofenac,solid phase extraction,back-flushing,macroreticular resin,pharmacokinetics