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华东理工大学分析测试中心，上海 200237)
摘要：
本文采用C18反相柱，研究了2，6－二氯嘌呤在不同pH的磷酸氢二钾缓冲液:甲醇流动相中，其最大吸收波长、紫外吸收值和保留时间的变化。结果表明，随者pH的下降，其保留时间延长，最大波长变小，紫外吸收值增加。同时建立了2，6－二氯嘌呤高效液相色谱（HPLC）分析方法，其采用diamonsil C18柱 150*4.6mm，磷酸氢二钾缓冲液（pH7.0）:甲醇=50:50，流速1.0ml/min，检测波长280nm，其线性方程Y=1900.7x ，相关系数R2=0.9999(n=3)，分析方法快速、准确。关键词 2,6-二氯嘌呤；高效液相色谱；pH
1 前言
2，6－二氯嘌呤(化学文摘号:5451-40-1)现作为合成嘌呤类抗癌药物的一种原料，其有关2，6－二氯嘌呤的HPLC分析国内外均未见报道。本文采用C18反相柱，以磷酸缓冲液:甲醇为流动相，研究了2，6－二氯嘌呤在不同pH缓冲液中，其最大吸收波长、紫外吸收值和保留时间的变化规律，同时建立了2，6－二氯嘌呤高效液相色谱（HPLC）分析方法[1]。
2 实验部分
2.1 仪器和试剂
岛津LC－6A，SPD－6AV紫外可见光度检测器,岛津UV－365 紫外分光光度计，pH计 PHS－2ST。
99.5％)；甲醇 HPLC级，磷酸氢二钾和磷酸均为分析纯。
2.2 色谱条件
色谱柱:diamonsil C18 150*4.6mm，5μm；流动相A：甲醇，流动相B：0.04M磷酸氢二钾缓冲液（磷酸调节至pH＝7.0），A：B＝50：50；流速：1.0ml/min；波长：280nm；灵敏度：0.02AUFS。
2.3 方法与结果
对照品溶液的制备 精密称取2,6-二氯嘌呤对照品适量，用流动相溶解于100ml的容量瓶中，制成含0.4g/L的对照品溶液。
线性范围 分别精密移取对照品溶液25ml、12.5ml、5ml、2ml、0.5ml于50ml容量瓶，配成200、100、40、16、4μg/ml的溶液，分别取20μl进样以对照品峰面积为纵坐标，以进样量为横坐标，得线性回归方程及相关系数：2,6-二氯嘌呤 y=1900.7x，r=0.9999(n=5)。
不同pH流动相最大吸收波长的测定 以0.04M磷酸氢二钾缓冲液(pH=5.0, 5.5,6.0,6,5,7.0)及重蒸水:甲醇＝50:50为溶剂，比色皿厚1cm，对对照品(40μg/ml)进行紫外扫描，其测定值见图1、图2。
图1 最大波长与流动相pH的关系
fig 1 the relationship between maximum wavelength and pH of mobile phase
图2 εmax与流动相pH的关系
fig 2 the relationship betweenεmax (mol-1·L·cm-1)and pH of mobile phase
不同pH流动相对分离的影响 以0.04M磷酸氢二钾缓冲液(pH=5.0,5.5,6.0, 6,5,7.0)及重蒸水:甲醇＝50:50为流动相，对2,6二氯嘌呤（990301）进行色谱分析，结果表明，pH对色谱分离有很大的影响，色谱图见图3，结果详见表1。
a pH5.0 b pH5.5 c pH6.0 d pH6.5 e pH7.0 f water
图3 2,6-二氯嘌呤在不同pH流动相中的色谱图
fig 3 the chromatogram of 2,6-dichloropurine in different pH mobile phase
表一 不同 pH的流动相对2,6-二氯嘌呤分离的影响
table 1 The influence to separation of 2,6-dichloropurine
in different pH mobile phase
| 保留时间（分）/pH reserved time(min)/pH |
5.0 |
5.5 |
6.0 |
6.5 |
7.0 |
Water |
|
2,6- 二氯嘌呤2,6-dichloropurine |
6.14 |
5.75 |
5.20 |
4.48 |
4.15 |
8.79 |
|
主要杂质 impurity |
6.63 |
6.67 |
6.78 |
6.52 |
6.33 |
6.73 |
样品测定
精密称取样品2,6-二氯嘌呤适量（约40mg），用流动相溶解于100ml的容量瓶中，再精密移取5ml于50ml容量瓶中，将样品配成约40μg/ml的溶液，取20ul进样，以标准曲线作参照，测得990301一次精制品含量为95.0%，二次精制品含量为99.3％。
3 讨论
(1) 在实验中发现，在不同pH流动相下，其2,6-二氯嘌呤最大吸收波长会发生变化，随着pH的下降而变小，但其紫外吸收值（ε）值却增加，而对于重蒸水则例外。因此在测定时，应严格控制pH值。
(2) 采用不同pH的缓冲液，2,6-二氯嘌呤的保留时间会发生明显变化，随着pH的下降，保留时间延长，而主杂质峰对pH的变化相对不敏感，当pH≤5.0时，二者严重重叠，因此流动相pH的选择是2,6-二氯嘌呤分析的关键。
(3) 当只用甲醇和水作为流动相，其色谱图同使用缓冲液流动相差异很大，不仅2,6-二氯嘌呤与主杂质出峰次序颠倒，而且出峰时间延长，并且柱效明显降低，分离不佳。因此，添加流动相改性剂可大大改善色谱条件。
(4) 2,6-二氯嘌呤中的主杂质，我们对其LC－MS分析，其最大波长在260nm左右，分子量为188.5，分子中含一个氯，分子式推断为C5HClN4O2，应为一种未报道的新嘌呤类化合物，其确定结构仍在研究中。
(5) 总之，实际分析中以中性缓冲液为好，2,6-二氯嘌呤与各杂质分离良好。
参考文献：
[1] WANG Jie ZHAO Lan-feng WANG Shu-li(王杰 赵岚峰 王树力译). Practical HPLC Method Development(实用高效液相色谱法的建立) . Beijing: Science Press(北京：科学出版社)，1998.228-235
Determination of 2,6-Dichloropurine
by High Performance Liquid Chromatography
SHI Chao-ou， ZHU Rui-rui，WU Yi-wen
Center of Analysis and Research East China University of Science and Technology
Shanghai 200237
Abstract：The varieties of the maximum wavelength、the UV absorption value and the reserved time with 2,6-dichloropurine were studied in different pH buffer with KH2PO4:CH3OH,using C18 column . The result indicated that the reserved time was extended、the maximum wavelength was decreased and the UV absorption value was increased with the decrease of pH. Meanwhile, A HPLC method has been developed for determination of 2,6-dichloropurine.The compound was separated on a C18 column,5μm,150×4.6mm i.d., using a methanol-phosphate buffer solution(50:50,pH7.0) as mobile phase, with UV detector at 280nm. The linear equation was Y=1900.7X, correlation coefficient was R2=0.9999(n=5). The method has been applied to the determination of samples with satisfactory results.
Keywords：2,6-dichloropurine； HPLC；pH