猪尿中盐酸克仑特罗残留量的检验方法

上  海  市  地  方  标  准       DB 31/XX-1999<br>

    Method for the determination of clenbuterol residue in pork urine
                                            （送审稿）

     1999-XX-XX发布                                   1999-XX-XX-实施
                                                                                        
             上 海市 质 量 技 术 监 督 局       发布
                                  

1. 范围

        本标准规定了圈养活猪尿中盐酸克仑特罗残留量的测定方法。
        本标准适用于圈养活猪尿中盐酸克仑特罗残留量的测定。

第一篇  酶联免疫法

2. 方法提要

        猪尿样品经缓冲液1/10稀释或进一步适当稀释后作为检测样品；猪组织内脏样品经均质、酶解、有机溶剂提取以及免疫亲和层析提纯后，作为检测样品。放置4℃环境，待检。
        包盖有特异性抗体的酶联反应板，经清洗后，分别将待检样品、标准品和酶标记物加入板孔中，进行竞争免疫反应，反应显色结果在450 nm波长下读取吸光值，在绘制的标准工作曲线中查算样品中盐酸克仑特罗残留量。

3. 试剂和材料
     
      除方法另有规定外，试剂均为分析纯，水为二次重蒸水或超纯水。
3. 1 盐酸克仑特罗酶联免疫试剂盒：英国RANDOX公司或类似产品。
3.2 盐酸克仑特罗免疫亲和层析柱试剂盒：英国RANDOX公司或类似产品。
3.3   1M盐酸。
3.4   1M氢氧化钠。
3.5   36%醋酸。
3.6   乙醇：70%，用醋酸（3.5）调节 pH至4.0。

上海市技术监督局 1999-XX-XX批准               1999-XX-XX 实施
 DB 31/XX-99

4.  仪器与设备

4. 1 酶联免疫反应读数仪。
4.2 组织均质器。
4.3 高速冷冻离心机和50ml离心管。
4.4 分析天平。
4. 5 可调温度式水浴锅。
4.6 微加样器：1~10L，10~100L。

5. 试样制备

     参照盐酸克仑特罗酶联免疫试剂盒和免疫亲和层析柱试剂盒要求制备。

6.  测定步骤

6. 1 所有检测试剂和待检样品，在施检前，在室温条件下放置30分钟。
6.2 缓冲溶液清洗酶联反应板后，分别加入待检样品、标准品和实验对照样品，每份样品做双孔试验，每孔加50L量。
6. 3 然后，每孔加25uL的酶标记物。
6.4 振荡混合反应板后，置室温条件下放置60分钟或4℃过夜。
6.5 用缓冲溶液清洗酶联反应板6次， 每次间隔10分钟。
6. 6 然后，每孔加125L反应底物，置室温条件下放置20分钟。
6.7 用1M盐酸中止酶联免疫反应。
6.8 在450nm波长下，读取吸光值。

7.结果报告

7.1 计算标准品、实验对照和样品的平均吸光值。
7.2 绘制标准工作曲线（标准品浓度取对数计算）。
7.3 从标准曲线中读取对照和样品的吸光值。
7.4 查出相对浓度，按试剂盒使用说明，液体和固体样品分别乘以不同的稀释系数。
7.5 使用酶联免疫试剂盒检测为阳性样品，必须用其他方法以与证实。


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第二篇 气相质谱联用法

8  原理

    样品用盐酸葡萄糖醛甙酶/芳基硫酸酯酶在pH=5.2的缓冲溶液中消化。萃取液用C18和SCX小柱、固相萃取净化，分离的药物残留经过双三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）衍生后,用带有质量选择检测器的气相色谱仪测定。

9  试剂

9.1 乙酸铵缓冲液（20mM,pH-5.2）、溶解1.45g乙酸铵于500-700mL水中，用乙酸调整pH值为5.2并稀释到1升。
9.2 -盐酸葡萄糖醛甙酶/芳基硫酸酯酶溶液30U/mL或相当者。
9.3 30mM盐酸：稀释30mL 1M盐酸到1升蒸馏水中。
9.4 甲醇：分析纯。
9.5  氨化甲醇（amonium methanol）：4%。用甲醇稀释4mL氨溶液（比重0.88）至100mL。
9.6 双三甲基硅基三氟乙酰胺，BSTFA。
9.7 甲苯：分析纯。
9.8 乙酸乙酯-异丙醇(6:4):分析纯。
9.9 C18小柱：supelclean LC-18 Sep Pak小柱 500mg，3mL。
9.10 SCX小柱：supelclean LC-SCX  Sep Pak小柱 500mg，3mL。
9.11 标准溶液
9.11.1 盐酸克仑特罗储备液：精确称取适量的盐酸克仑特罗标准品，用甲醇配成浓度约1mg/mL的标准储备液。
9.11.2  盐酸克仑特罗标准工作液：将储备液用甲醇稀释为0.05～2.0g/mL,存放在冰箱中备用。

10 仪器及设备

10.1   离心瓶，具塞，50mL。
10.2   Sep-Pak真空接头。
10.3   具聚四氟乙烯拧盖的试管。
10.4   酸度计。
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10.5   机械真空泵。
10.6   触摸式震荡器。
10.7   恒温箱，373℃。
10.8   恒温箱，803℃。
10.9   恒温箱，1003℃。
10.10  气相色谱仪，配质谱检测器。

11   试验步骤

11.1   提取：
    用移液管移取5.00mL尿样于50mL具塞的离心管中，用乙酸调整pH值至5.2，加入1mL 20mM的乙酸铵缓冲溶液，加入50L盐酸葡萄糖醛甙酶溶液，拧紧盖子，震荡、超声15min，于37℃培养18hr。加入10mL乙酸乙酯-异丙醇混合液，震荡15min，用滴管收集有机相，用10mL上述混合液重复提取一次，合并两次提取的溶液于一玻璃试管中，用氮气吹干。用1mL 20mM的乙酸铵缓冲溶液溶解。
11.2   净化
    装好真空泵和接管，将C18和SCX固相萃取柱按从上到下的顺序安装。依次用5mL甲醇、5mL水和5mL 30mM盐酸活化，移取1.00mL滤液至C18柱中，用1mL 20mM的乙酸铵缓冲溶液冲洗试管并一起转移至C18柱中,依次用5mL水、5mL甲醇淋洗柱子,在溶剂流过固相萃取柱后，保持抽气5min使柱中的液体逐渐枯竭,取下C18柱。用5mL 4%氨化甲醇淋洗SCX柱并收集流出液于具塞玻璃试管中。
11.3  衍生化
    用氮气吹干上述流出液,用100L甲苯溶解残渣,加入100L BSTFA，加盖并于触摸式震荡器上震荡,在80℃的烘箱中加热lhr。蒸干多余的溶剂，用0.5mL甲苯溶解。取适量的盐酸克仑特罗标准工作液，同时衍生化,用气质联用仪选择离子监测方式检测。
11.4 检测
11.4.1  气相色谱条件
11.4.1    色谱柱：HP-5MS 5%苯基甲基聚硅氧烷，30m×0.25mm（内径），0.25m（膜厚）；
11.4.1.1   进样口：220℃；
11.4.1.2   进样方式：不分流；
11.4.1.3   进样体积：2L；
                                                             
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11.4.1.4   柱头压（70℃）：7.6psi；
11.4.1.5   柱温：70℃（保持0.6min）,  以25℃/min升温至200℃（保持6min），以25℃/min升温至280℃（保持5min）；
11.4.1.6   载气：He: 流速：0.9mL/min（恒流）。
11.4.2    质谱条件
11.4.2.1   GC/MS 传输线温度：280℃；
11.4.2.2   溶剂延迟：8min；
11.4.2.3   EM电压：高于调谐电压200V；
11.4.2.4  分析器温度：230℃；
11.4.2.5  四极杆温度：106℃。
11.4.2.6 选择离子监测:(M/Z)86，243，262，277。
11.5   测定
    根据样品液中盐酸克仑特罗含量情况，选定峰面积相近的标准工作溶液。标准工作溶液和样品液中盐酸克仑特罗响应值均应在仪器检测线性范围内。对标准工作溶液和样品液等体积参插进样测定。
    定性：样品峰与标样的保留时间之差不多于3秒，Q值应大于80，当Q值小于80时，应通过人工比较选择离子的丰度，以基峰百分数表示。
11.6  计算
                    h×Cs×V 
                X＝━━━━━━
                                            hs×m
式中:  X—试样中克仑特罗残留含量,mg/L;
       h─样液中经衍生化盐酸克仑特罗的峰高,mm;
　　   hs─标准工作液中经衍生化盐酸克仑特罗的峰高,mm;
       Cs—标准工作液中盐酸克仑特罗的浓度,g/mL;
       V—样液最终定容体积,mL;
       m—最终样液所代表的试样量,mL。
       注:计算结果需将空白值扣除。

12   精密度和灵敏度

    在上述色谱条件下，盐酸克仑特罗保留时间约为11min。本方法的检测限为5g/Kg，回收率为8015%。
              
                      DB 31/xx-1999

附加说明：
本标准由上海市质量技术监督局提出。
本标准由上海市畜牧办公室归口。
本标准由上海出入境检验检疫局负责起草。
本标准由上海市兽药饲料监察所、上海市疾病预防控制中心共同参加起草。
    本标准主要起草人：顾鸣、朱坚、郭德华、陶军、关嵘、黄士新 。                   
  
 
标准编制说明

一、制定本标准的必要性和重要性：
    -兴奋剂是一类受体激动药物，临床医学主要用于平喘、止咳和祛痰的治疗。近年来，此类药物（主要是盐酸克仑特罗，商品名为氨哮素、双氯醇胺，英文名为Clenbuterol；沙丁胺醇，商品名为舒喘灵、嗽必妥，英文名为  Salbutamol）被应用于畜牧养殖业，在预混料及饲料添加剂中掺入喂养猪等动物，使猪瘦肉率高、肉色好、单位售价高。由于此类化合物性质稳定，作用持久，由肝、肾代谢，可在动物组织内蓄积。近年来，发生多起因食用市售猪肉和内脏的中毒事件；内地供港猪肉也曾发生类似事件，一度造成外贸活动中断。为此，对畜牧养殖企业使用-兴奋剂的管理和监测，是确保广大市民食用“放心肉”的必要措施。

二、制定本标准的依据：
    目前国内尚无标准方法和检测试剂，本标准主要依据香港政府化验所推荐的方法和试剂盒，并经实际检测应用确认。

三、本标准方法特性：
    特异性：克仑特罗100%
                        沙丁胺醇 86%
检测下限 猪尿液 猪内脏组织
克仑特罗
沙丁胺醇 1. 0ng/g
1.2ng/g 0. 5ng/g
0.6ng/g

    该酶联免疫方法灵敏度高、特异性好、操作方便、整个检测过程约3小时，适宜基础单位的普查和常规检测使用。目前认为本方法检测的阳性结果，需要用其他方法（GC、HPLC、GC/MS等）确证，阴性结果则否。
    气相-质谱法是根据“香港政府化检所”提供的方法为依据，经过本实验室验证后制定的。用添加法进行回收率试验，当添加浓度在0.02～0.1mg/kg时,回收率在70%～90%之间。
    据悉，本方法从1998年起使用至今，已在输香港活猪样品的克仑特罗残留量测定中使用，起到了很大的作用。