高效液相色谱法分析中药及植物药的进展

摘　要　近来中药及植物药在全世界范围内受到人们的普遍重视，建立了许多分离测定中药及植物药中活性组分的分析方法。综述了高效液相色谱法(HPLC)分析中药及植物药方面的进展，此外还就中药HPLC分析中色谱技术方面的进展进行了讨论。 Abstract　The applications and development of high performance liquid chromatography in the analysis of Chinese traditional medicines and plant medicines are reviewed here. 101 references are cited. 1　引　　言 　　植物药越来越受到人们的重视。据报道，全世界大约有70%的人口医疗依靠各种类型的植物药〔1，2〕。对植物药的兴趣主要基于以下两个原因，一是人们普遍认为植物药具有较小的毒性，二是用合成方法寻求新药物的可能性变得越来越小，同时已有的西药对一些疑难病症无能为力。随着对植物药需求的不断增长，开展植物药的药代动力学、毒理学研究和质量控制，开发快速、灵敏、具有选择性的分析方法也越来越迫切。过去20年的实践经验表明，高效液相色谱（HPLC）是一种非常有效和普遍适用的植物药分析方法。近来，由于各种分析柱、高选择性和高灵敏度的检测器和复杂的商品化仪器联用系统的出现，植物药分析领域已被大大地推进。本文就HPLC在中药及植物药研究中应用的最新进展做简要评述。 2　色谱技术方面的进展 2.1　固定相 　　在过去的几年里，出现许多适于碱性物质分离的商品色谱柱, 其填料具有更好的重现性、更高的耐酸碱稳定性以及不易受次级保留影响。此外，使用新的固定相载体和将各种配体键合到常用的载体上，从而提高了反相色谱、离子色谱、离子交换色谱填料的选择性。与此同时，新的手性固定相不断出现，应用范围不再局限于个别的化合物〔3〕。 　　Theodoridis比较了专门为碱性化合物的HPLC分析设计的新柱添料，其中包括有硅胶基体的C18-羟基、硅胶基体的C18和C8、硅胶基体的甲基苯基-丙基甲硅烷基、以氧化铝和聚苯乙烯-二乙烯基苯为基体的聚丁二烯填料。在每个被检验柱子上进行了流动相优化，并研究了流动相pH、有机改性剂性质、含量和盐浓度对保留选择性和分离度的影响。实验表明，当基于分析物间pKa值的差异进行分离时，洗脱液的pH值是影响分离的一个重要因素。碱性化合物在这样的C18柱和聚合物柱上能得到满意的分离结果，这些新柱填料已被用于金鸡纳生物碱和长春花生物碱的分析〔4，5〕。 　　众所周知，光学异构体有不同的药理活性。Kusu等〔6〕用一手性配位体交换柱，以1 mmol/L醋酸铜和20 mmol/L醋酸铵（pH=6.4）的混合水溶液为流动相直接拆分了柑橘属植物、中药材、中药中的脱氧肾上腺素光学异构体，在0.2～100 μmol/L浓度范围内有很好的线性(r=0.999)，检测限可达0.2 μmol/L (S/N=3)。 　　一系列具有两个或三个活性中心的四环、五环长春花生物碱的立体异构体能够在手性α1-酸糖蛋白（AGP）和人血清白蛋白（HAS）柱上得到分离〔7〕。以磷酸盐缓冲溶液（pH 5～7）/乙腈（ACN）或异丙醇为流动相，比较两种柱上得到的谱图，发现这类化合物与AGP固定相有更大的亲合力。在应用范围和立体选择性方面，AGP柱都优于HAS柱。 2.2　检测 　　紫外检测仍是最普遍的检测方法，与此同时其它检测方法显示出了不可替代的优越性。 2.2.1　电化学检测器　Kusu和其合作者〔8〕在分析枳实和枳壳中的脱氧肾上腺素，N-甲基酪胺时发现电化学检测器不仅有特殊的选择性，而且具有很高的灵敏度，而以往用紫外检测需要复杂的样品预处理才能避免样品中其它组分的干扰。在Kaseisorb LC-ODS-120-5色谱柱上，以0.02 mol/L柠檬酸-0.02 mol/L NaH2PO4（7：3 V/V，pH=3）为流动相，检测电位1.2 V(vs. Ag/AgCl)，去甲肾上腺素为内标，脱氧肾上腺素、N-甲基酪胺的检测限分别为1.3 μg/L和1.2 μg/L。青蒿素及其类似物既无强紫外吸收也无荧光发色团，且没有合适的衍生反应，因此很难对它们及其代谢产物进行HPLC分析，Chan〔9〕用HPLC-电化学检测器（ECD）测定了血浆中的青蒿素。 2.2.2　光电二极管阵列检测器 光电二极管阵列检测器已被普遍用于鉴别液相色谱的峰纯度和提高重叠峰的定量准确度〔10，49，63，64〕。美登（maytus）中的美登类化合物（maytansinoids）是一类很强的抗癌药物，这类物质具有很相似的结构，分子间的差异很小，给分析带来困难。Reich等人〔11〕利用Varian 9065二极管阵列检测器为这类物质建立了一个光谱数据库，即使在分析物没有得到基线分离的情况下，这一谱库也能大大简化在复杂植物萃取物的未知基质中识别已知化合物。在此基础上，分别在硅胶、双醇基、氨基和氰基柱上对这类物质进行了系统研究，基于分子大小和与固定相特效的相互作用提出了此类物质复杂的保留机理。 2.2.3　蒸发光散射检测器（ELSD）　ELSD是一种质量型检测器，流动相被气流雾化后进入加热管，在管内溶剂被挥发，一束狭窄光通过分析物粒子后发生散射，散射光由光电倍增管收集，它的响应取决于被分析物粒子的大小和数目。由于ELSD只对不挥发的物质响应，其特点是，即使在梯度洗脱的情况下也能得到比较平稳的基线。现在这一检测器已被成功地用于不挥发物质的分析，如：糖类、脂类、活性剂等。人参是常用的强身滋补品，有抗疲劳、镇静、抗胃溃疡等效用。许多研究表明，这些药效源于活性组分人参皂甙。由于人参皂甙缺少发色团，用紫外检测器检测这类物质时，只能在短波区。在短波区内检测，用梯度洗脱同时分离多个人参皂甙时，基线漂移严重，影响分析的准确度。Park等〔12〕用HPLC-ELSD同时分离和测定了人参皂甙Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1、Rg2、Rg3 和Rh1等。ELSD的管温设置在145℃，N2流量40 mm(转子流量计单位)，检测限在35～155 ng之间。此方法的灵敏度和选择性都优于HPLC-UV，在一次洗脱中完成主要人参皂甙的定量分析。 2.2.4　质谱　近来，液相色谱-质谱（LC-MS）联用，尤其是液相色谱-质谱-质谱（LC-MS-MS），已成为发展最快的分析技术之一。样品引入由最早的传送带到目前液体样品的直接引入，离子化技术由热喷雾（TSP）、连续流快原子轰击（CF-FAB）、粒子束接口（PB），发展到现在的大气压化学电离（APCI）和电喷雾离子化（ESI）。 PB 的缺点是对难挥发性物质的灵敏度低，因此不适于天然产物中极性物质的分析；热喷雾接口虽已成功地用于极性和难挥发物质的分析，但对操作条件却有很高的要求。CF-FAB克服了TSP 的一些缺陷，但设备上的要求又使这项技术的应用受到限制。电喷雾接口是在常温常压下离子从液相直接被引入，而大气压化学电离（APCI）的样品离子是经过化学电离产生的，离解过程对温度控制的要求不像TSP-MS那么严格，在同样的汽化条件下可用于更多化合物的分析。ESI过程取决于溶液的化学性质、待分析离子的电迁移和表面行为。与ESI相反，APCI过程则取决于气相的化学性质，如：气体的酸碱性〔13〕。在质谱中所采用的接口技术受样品极性的影响。随样品极性从非极性至离子型逐渐增加，按如下顺序采用相应的质谱接口：气相色谱（GC）、PB、TSP、APCI和ESI。APCI有较宽的使用范围，从非极性到离子型化合物都可分析〔14〕。 　　新的接口技术和离子化方法的发展使HPLC-MS在分析化学上起着不可替代的作用。植物类天然产物成分复杂，甚至含有多达几千种组分，但往往只是一种化合物和植物的药效或毒性有关，因而在分离植物萃取物中的活性组分时，希望检测技术能为色谱峰提供尽可能多的定性信息。质谱技术部分地满足了这种需要。 　　前面已经提到，人参皂甙是人参萃取物中的活性组分，由于它缺少发色团，限制了紫外检测器的应用。1995年Van Breemen等〔15〕采用电喷雾离子化法，首次将LC-MS技术用于分析人参粗提物中的人参皂甙。基于分子离子峰和基准物的保留时间等信息，未经衍生的人参皂甙Rg1、Re、Rd、Rc、Rb2和Rb1直接被检测出来。Chuang等用紫外和电喷雾质谱（ESI-MS）检测，测定黄连中的7种生物碱〔16〕。通过追踪选定的离子来解决重叠峰问题，用诱导碰撞分解反应获得单个组分的结构信息。50 min内分离测定了黄连粗提物中的Berberstine、黄连碱、小檗碱、巴马亭、药根碱、表小檗碱和非洲防己碱。Wada 等〔17〕用LC-APSI-MS测定了日本乌头中的生物碱。另有报道〔18〕用TSP-MS分析银杏中的银杏苦内酯，检测限可达1 ng，灵敏度可以和GC-MS相媲美。Gobbato等〔19〕为了克服紫外检测选择性低，二极管阵列检测对结构类似的双黄酮分辨不清等缺陷，用HPLC-TSP-MS分析了银杏提取物中的双黄酮。最近，Brolis等用HPLC-二极管阵列检测（DAD），HPLC-TSP-MS和HPLC-ESI-MS检测，在一个反相大孔C18柱上分析了连翘中黄酮类、萘蒽酮类、间苯三酚类等16种组分〔20〕。 2.3　计算机模拟优化 　　在分离复杂的混合物时，计算机模拟优化正在发挥着越来越重要的作用。DryLab是一个商品计算机软件，能够快速、系统地开发HPLC方法的专家系统。仅仅依靠两次预实验，便可得到有关色谱条件的大量信息。此软件已被广泛用于各种样品的HPLC分析方法的开发，如核酸、蛋白质及复杂的天然产物等〔21〕。Metzger等〔22〕用DryLab软件辅助优化，从而确定了最佳的梯度时间、陡度、洗脱液的pH、柱类型、流速程序等，对番泻果和叶中的17个蒽醌类化合物进行了分离测定。在两次预实验的基础上，一个常规控制银杏质量的HPLC分析方法的开发仅用了8 h，预测的可靠性令人满意，预测值和实验值之间的平均标准偏差小于0.4%〔23〕。另外，借鉴已有的分析黄酮的实验条件，Dzido用DryLab优化了分析蜀葵属植物中的黄酮类的梯度洗脱方法〔24〕。本实验室用DryLab开发了HPLC测定大黄中羟基蒽醌类化合物的方法。在优化条件下，对比了不同产地大黄中有效成份的差异，并考察了样品制备方法对提取效率的影响〔25〕。 2.4　其它 　　由于中药剂型的复杂多样，识别中药中的掺假物对于质检部门来说无疑是一个很大的挑战。商用系统REMEDI HS已被用于检查中药中人工合成的中性碱性掺假物〔2〕。这个系统包括一个在线样品净化装置和一个含有555个药物和代谢物的数据库。在消费者提供的五种中草药中苯甲二氮、利眠宁、sulpiride、etenzamide、咖啡因和胃复安等合成药物被识别出来。 3　HPLC在中药及药用植物分析中的应用 3.1　植物药 　　植物药分析的主要目的是：（1）通过真实样品和未知样品的谱图对比，控制植物药的质量；（2）分离测定植物药中的活性组分满足临床用药和药理研究的需要；（3）为活性组分的制备分离摸索条件；（4）开发新的中药资源。中药中的活性组分的提取一般采用水煮，醇、氯仿、石油醚等有机溶剂提取，提取方法包括索氏提取、超声波萃取和超临界流体萃取。洗脱方式一般为反相等浓度洗脱，对复杂样品的分析梯度洗脱则有很多优越性。研究最多的药效活性组分有生物碱、各种甙类、黄酮、有机酸、香豆素等。表1列出了用HPLC分析植物药中这些活性组分所采用的色谱条件及检测方法。 表1　HPLC在药用植物分析中的应用 Table 1　Applications of high performance liquid chromatography (HPLC) in analysis of medicinal plants 药用植物 Medicinal plant 活性组分 Active constituents separated 分析柱 Column 流动相 Eluent 检测器 Detector (nm) 备　注 Remarks 参考文献 Reference 芍药 Paeoniae Radix 没食子酸，芍药酮，白芍药甙，芍药甙，苯甲酸，黄陪酰单宁， 羟基芍药甙，苯甲酰白芍药甙 Gallic acid, Oxypaeoniflorin, Albiflorin, Paeoniflorin, Paeonol, Benzoic acid, Pentagalloylglucose, Benzoylalbiflorin Cosmosil 5C18-MS (5μm) 25 cm×4.6mm i.d. ACN/50mmol/L-KH2PO4/0.1%H3PO4 UV 254 　 36 柴胡　Bupleurum 柴胡皂甙　Saikosaponins Nucleosil C18 25cm×4.6mm i.d H2O/CH3OH (34∶66) UV208 30℃ 37 龙胆 Gentiana manshurica 龙胆苦甙, 当药苦甙，当药甙，苦龙胆酯甙，苦当药酯甙 Glycosides Zorbax ODS 25cmx4.6mm i.d H2O/CH3OH 梯度 Gradient UV254 40℃ 38 黄芩 Scitellariae 葛根 Puerariae radix 黄芩甙 Baicalin 葛根素　Puerarin Cosmosil 5C18 15cm×4mm (5μm) 0.03%H3PO4/ACN （79∶2）或（87∶13）和2%HAC/CH3OH（79∶21） UV250 UV270 　 39 栀子 Gardenia jasminoides and Gardenia jasminoides var. grandiflora 羟异栀子甙，京尼平，栀子甙，京尼平甙酸 Gardenoside, Genipin, Geniposide, Geniposidic acid Nova-Pak phenyl column 15cm×3.9mm i.d ACN/H2O/HClO4 (6∶94∶1) pH4 DAD 238 室温 Ambient 40 重楼 Rhizoma paridis 甾体皂甙 Steroidal saponin Symmetry C8 25cm×4.6mm i.d ACN/H2O （42：58） UV 203 40℃ 41 桑叶 Mulberry leave 芸香甙，槲皮素 Rutin, Quercetin YWG-C18 CH3OH/H2O/H3PO4 60∶40∶0.4 UV 257 　 42 肉苁蓉 Cistanche 苯已醇甙类 Phenylathanoid Glycosides Alltima C18 (5　μm) 25cm×4.6mm i.d ACN/1.5%乙酸HAc 梯度 Gradient UV 335 　 43 红景天 Rhodiola Saera Fu 红景天甙 Salidroside Shim-Pack ODS (5　μm) 15cm×4.6mm i.d CH3OH/H2O (2∶5） UV 280 40℃ 44 积雪草 Centella asiatica 积雪草苷，亚细亚酸 Madecassic acid, Madecassoside μBondapak C18 (10μm) 30cm×3.9mm i.d H2O/ACN 梯度 Gradient UV 220 　 45 肉桂 Cinnamomi ramulus 芍药 Paeoniae radix 桂皮酸 (1)，芍药甙 (2) Cinnamic acid, Paeoniflorin LiChrospher R-18 12.5cm×4mm i.d (5μm) H2O/ACN/CH3OH/HAc(610∶340∶50∶1)(1) (800∶150∶50∶1) (2) UV280 (1) UV250 (2) 　 46 獐牙菜 Swertia 苦甙 Iridoids μBondapak C18 30cm×3.9mm i.d H2O/ CH3OH/异丙醇(isopropyl alcohol)/THF（65∶30∶5∶1） UV 240 15℃ 47 鼠尾草 Genus Salvia 丹参酮 Tanshinones YWG-C18H37 CH3OH/H2O （77∶23） UV 254 室温 Ambient 48 金盏花 Calendula officinlis 黑接骨木 Sambucus nigra 黄酮甙 Flavonol-2-O-glycosides C8 Aquapore RP 300 22cm×2.1mm i.d (7μm) (CH3)2CHOH-THF-H2O (10∶5∶85) (CH3)2CHOH-THF-H2O (12∶4∶84) DAD 　 49 银杏叶 Ginkgo biloba 金盏花 Calendula officinlis 椴树叶 Tilia cordata 黄酮醇甙 Flavonol glycosides Aquapore RP-300 22cm×4.6mm i.d (CH3)2CHOH-THF-H2O（10∶5∶85） (CH3)2CHOH-THF-NH4AC(10∶5∶85) MS 　 50 银杏 Ginkgo biloba 类黄酮 Flavonoids Nucleosil 100-C18 (3μm) 10cm×4mm i.d 1.A. CH3OH B.THF C.0.5% H3PO4 梯度 Gradient 2.A.(CH3)2CHOH-THF(25∶65) B.ACN C.0.5% H3PO4 梯度 Gradient UV370 UV350 30℃ 30℃ 51 银杏叶 Ginkgo biloba leaves 类黄酮 Flavonoids Zorbax ODS C18 15cm×4mm i.d (5μm) A．CH3OH B．THF/H2O/CH3COOH（34∶65∶1） 梯度 Gradient UV350 25℃ 52 朝鲜淫羊藿 Epimedium koreanum nakai 淫羊藿甙 Icariin Shim-Pack CLC-ODS 15cm×6mm i.d (5μm) ACN/H2O (30∶70) UV 270 25℃ 53 木属 Aralia 类黄酮 Flavonoids 香豆精 Coumarin Supelco SIL-LC-18 15cm×4.6mm i.d (5μm) A. 40% CH3OH B. CH3OH 梯度 Gradient UV 276 UV 343 UV 361 UV 272 　 54 黄芪 Astragalus 异黄酮 Isoflavonoids Nucleosil C18 25cm×4.6mm i.d (5μm) CH3OH/H2O （3∶2）和（1∶1） UV 254 UV 280 室温 Ambient 55 蒲黄 Typha 类黄酮 Flavonoids μBondapak C18 (CH3)2CHOH/THF/H2O (14:2.5:83.5) UV 287 25℃ 56 红花 Flowers of Carthamus tinctorius 黄酮醇 Flavonols YWG-C18 25cm×4.6mm i.d (10μ) CH3OH/H2O/H3PO4 (48.5∶51.5∶0.25）pH　3.5 UV360 室温 Ambient 57 藁本属 Ligusticum 阿魏酸，莨菪亭，正丁苯酞，藁本内酯，藁本内酯二聚体 Feralic acid, Scopoletin, 3-Butyl-phthalide, Ligustilide, Diligustilide Hypersil-C18 10cm×2.5mm i.d(5μm) ACN（含1.25% CHCl3）H2O（CHCl3饱和） 梯度 Gradient DAD 284 　 58 羌活 Notoperygium incisum, N. forbesii 异欧前胡素，紫花前胡甙，羌活醇 Isoimperatorin, Nodakenin, Notopterol Inertsil ODS-2 15cm×4.6mm i.d CH3OH/H2O （33∶67） UV330 40℃ 59 补骨脂 Fructus Psoraleae 补骨脂素 Psoralen 异补骨脂素 Isopsoralen CLC-ODS 15cm×6mm i.d CH3OH/H2O （0.6∶0.7） UV 295 　 60 黄连-吴茱萸　Coptis-evodia 生物碱 Alkaloids Cosmosil 5C18-Ms (5μm)(25cm×4.6mm i.d CH3OH/50　mmol/L　NaAc-0.25% HAc pH 5.09 梯度 Gradient UV250 　 61 川乌 Radix Aconity 附片 Radix Aconity Lateralis Preparata 乌头碱，中乌头碱，下乌头碱 Aconitine, Mesaconitine, Hypaconitine Shim-Pack CLC-ODS 15cm×6.0mm i.d CH3OH/H2O/ACN(67∶33∶2)含6mmol/L SDS和20mmol/L NaH2PO4 pH4.5 UV235 35℃ 62 吴茱萸　Evodiae fructus 生物碱　Alkaloids Capcell C18 SG-120 醋酸盐缓冲液　Acetate buffer/ACN/CH3OH 梯度gradient DAD 250 　 63 花菱草 Eschscholtzia californica cham. 生物碱 Alkaloids LiChrosorb Si 60 25cm×4.0mm i.d (7μm) CHCl3/CH3OH (90∶10)含0.1%TFA DAD 292.5 20℃ 64 苦地丁 Corydalis bungeana 异喹啉生物碱 Isoquinoline TSK-120A (5μm) 15cm×4 mm i.d 0.025　mol/L NaH2PO4/CH3OH(35∶65)　0.1%SDS pH8.0 UV289 室温 Ambient 65 千金藤属 Stephania 生物碱 Aalkaloids Lichrosorb RP-C18 15cm×4.6mm (5μm) A:CH3OH/H2O/10%TEA（50∶50∶0.5） B:CH3OH/10%TEA（100∶0.5）梯度　Gradient UV 282 室温 Ambient 66 延胡索 Corydalis yanhusuo W.T.Wang 延胡索乙素 dl-Tetrahydrapalmatine YWG 20cm×4.6mm i.d (5μm) CH3OH/磷酸盐缓冲液（phosphate buffer), pH 7.2（75∶25） UV 280 室温 Ambient 67 五味子 Kadsura interior A.C. Smith 五味子甲素，五味子醇甲，五味子醇乙，戈米辛G，内南五味子素，内南 五味子酯乙，五味子酯丁，南五味子宁 Dibenzocylooctadiene lignans LiChrosorb RP-18 20cm×4.6mm (5μm) H2O/CH3OH （30∶70） UV254 30℃ 68 厚朴 Magnolia officinalis 厚朴酚 Magnolol 和厚朴酚 Honokiol Nucleosil 7C18 25cm×4mm i.d (7μm) ACN/0.1%H3PO4 （65∶35） DAD 209 218 室温 Ambient 69 牛蒡子 Fructus arctii 牛蒡甙 Arctioin 牛蒡甙元 Arctigenin RP C18 25cm×4mm i.d H2O/CH3OH （1∶1） UV270 　 70 连翘 Forsythia suspensa 咖啡酸，连翘酯甙，连翘甙，芦丁，连翘脂素 Caffeic acid, Forsythoside A, Forsytin, Rutin, Forsythigenin Nucleosil C18 25cm×4.6mm i.d (7μm) CH3OH(含1%THF)/H2O(10mmol/L KH2SO4 pH3.2) 梯度 Gradient UV280 22℃ 71 山荷叶 Rhizome of Diphylleia Sinensis Li 木脂素 Lignans C18 25cm×4mm i.d ACN/CH3OH/H2O/H3PO4 (8∶38∶54∶0.01) UV215 25℃ 72 仙茅 Curculiginis rhizoma 仙茅甙 Curculigoside LiChrospher 100 RP-18 25cm×4.6mm i.d (5μm) H2O/ACN/CF3COOH (800∶200∶1) UV283 40℃ 73 泽泻 Alismatis rhizoma 三萜 Triterpenes YMC-Pack ODS-AS-5 25cm×4.6mm i.d Aqueous 50%ACN梯度　Gradient UV210 50℃ 74 紫杉针叶　Taxus media needles 紫杉酚　Taxol Rainin 80-D15-C5 15cm×4.6mm i.d ACN/CH3OH/H2O（12∶55∶33） UV 228 UV 280 　 75 枸杞子 Lycium barbarum L. 牛磺酸 Taurine Zorbax-C8 25cm×4.6mm i.d (5μm) CH3OH/10mmol/L NaAc, pH6.8 (35∶65) UV330 　 76 3.2　中药方剂 　　中药方剂一般由几种甚至几十种中药材组成，化学成分非常复杂。目前我们对中药方剂中的有效成分的认识还相当有限，有待开发准确地评价中药方剂质量的分析方法。人们由分析中药复方制剂中的一种活性组分到分析几种活性组分，逐渐提高评价中药制剂的水平。日本和台湾的健康福利部门都已明确规定，凡申请检察和注册的中药制剂必须包括至少两个做为质量指标的化学成分的含量分析。 　　Wen等对3种含黄芩、葛根的中药复方制剂中的黄芩甙、葛根素进行了测定〔26〕。Lee以0.03%磷酸/乙腈（V/V）为流动相在Cosmosil 5C18-AR柱上用梯度洗脱同时测定了由多味药材构成的中药复方制剂中的甘草甙、甘草甜素、橙皮甙、桂皮酸、桂皮醛、厚朴酚、和厚朴酚等7种活性组分〔27〕。在同样的柱和流动相条件下，Lin等以对羟基苯甲酸丙酯为内标，测定了中药制剂中的龙胆苦甙、芒果甙 、小檗碱、黄芩甙、 次黄芩素和甘草酸〔28〕。表2中列出了近年来为分析中药制剂中的活性组分开发的HPLC方法。 3.3　生物样品 　　为了安全、合理、有效地使用药物，需要了解药物体内过程的信息，药代动力学研究药物及其制剂的体内过程（吸收、分布、代谢、排泄）、作用机理及药物效应。建立药物药代动力学模型的先决条件是开发出能够准确测定药物母体化合物及其代谢产物在各种体液中的浓度，分析的质量则取决于方法的有效性和样品设计，如：取样数目、时间间隔、取样体积等。由于HPLC的选择性好，自动化程度高，分析时间短等优点，多数实验和临床的药代动力学研究都采用这一分析方法。 表2　HPLC在中成药分析中的应用 Table 2　Applications of HPLC in analysis of Chinese traditional preparations 中成药及中药方剂 Chinese traditional preparations 活性组分 Active constituents separated 分析柱 Column 流动相 Eluent 检测器 Detector (nm) 备　注 Remarks 参考文献 Reference 伸筋丹 Shenjin Dan 士的宁 Strychnine Ultrasphere-Cyano 15cm×4.6mm i.d (5μm) CH3OH/H2O/HAc/TEA (1960∶31∶6∶3) UV254 　 77 Shuen-Feg-Iun-Chi-San Ban-shia-Bai-Ju-Tian-ma-Tang Tsan-Siang-Tian-Ma-Tang 派立辛 Parishin Inertsil ODS-2 25cm×4.6mm i.d (5μm) 0.1%H3PO4/ACN 梯度 Gradient UV222 　 78 芎芷香苏散流浸膏 Xiongzhi xiangsu-powder 橙皮甙 Hesperidin μ-Bondapak C18 30cm×3.9mm i.d CH3OH/1.5mol/L HAc (3∶7) UV280 　 79 益气聪明丸 Yiqi congming wan 葛根素 Puerarin Shim-Pack CLC-ODS 15cm×60mm i.d H2O/CH3OH（75.3∶24.7） UV248 35℃ 80 万氏牛黄清心丸 Wanshi niuhuang qingxin wan 小檗碱 Berberine 黄芩苷 Baicalin Spherisorb C18 25cm×4.6mm i.d (5μm) H2O/ACN（75∶25）pH　2.6含0.7%TEA UV274 　 81 加味逍遥散 Jawei xiaoyao san 柴胡皂甙,甘草酸, 牡丹酚, 芍药甙, 山栀子甙, 苍术内脂，姜辣素 Saikosaponins, Glycyrrhizin, Paeonol, Paeoniflorin, Geniposide, Astractylenolide Ⅲ and,6-Gingerol Inertsil ODS-2 25cm×4.6mm i.d (5μm) A 0.1% HAc in ACN B 0.1% HAc 梯度 Gradient DAD 40℃ 82 心舒安 Xinshuan granules 芍药甙 Paeoniflorin Nucleosil C18 15cm×4.6mm i.d (7μm) H2O/ACN（85∶15） UV230 　 83 Sann-Joong-Kuey-Jian-Tang 龙胆苦甙, 芒果苷, 巴马亭, 甘草酸, 小檗碱, 黄芩苷, 黄芩素 Gentiopicroside, Mangiferin, Palmatine, Glycyrrhizin, Berberine, Baicalin, Wogonin Cosmosil 5C18-MS 15cm×4.6mm i.d 0.03%H3PO4 ACN梯度 Gradient UV254 　 84 归芪口服液 Angelica sinensis and Astragalus membranaceus oral medication solution 阿魏酸 Ferulic acid KYNO-ODS-C18 22cm×4.6mm i.d (10μ) CH3OH/ACN/1%冰醋酸 (1∶1∶2) UV323 　 85 虚寒胃痛冲剂 Xuhan stomachache infusions 芍药甙 Paeoniflorin ODS C18 15cm×3.9mm i.d (4μ) H2O/CH3OH （72∶27） UV230 　 86 Wuu-Ji-San 甘草根亭, 甘草酸，橙皮苷, 肉桂酸, 肉桂醛, 厚朴酚, 和厚朴酚Liquiritin, Glycyrrhizin, Hesperidin, Cinnamic acid, Cinnamldehyde, Honokiol, Magnolol Cosmosil 5C18-AR 15cm×4.6mm i.d (5μ) ACN/0.03% H3PO4 梯度 Gradient UV254 　 87 Hsiao-Cheng-Chi-Tang 没食子酸，柚皮甙，番泻甙A，番泻甙B，厚朴酚，和厚朴酚，大黄素，橙皮甙 Gallic acid, Naringin, Senoside A, Sennoside B, Magnolol, Honokiol, Emorin, Hesperidin Cosmosil 5C18 25cm×4.6mm i.d A NaAc-HAc/ACN（9∶1） B CH3OH/ ACN/1%HAc（9∶9∶2） 梯度 Gradient UV280 　 88 八珍方 Bazhen formulations 芒柄花甙 Ononin Ultraspheretm-ODS-C18 25cm×4.6mm i.d H2O/CH3OH (45∶55) UV254 　 89 舒心口服液 Shuxin oral solution 阿魏酸 Ferulic acid Spheri RP-18 25cm×4.6mm i.d (5μ) CH3OH/5% HAc (23∶77) UV322 　 90 复方祖师麻注射液 Zushima injection 瑞香素 Daphnetin YQG C18 15cm×4mm i.d (5μ) 10mmol/L-H3PO4/ACN (17∶3) UV328 35℃ 91 生脉粉针 Shengmai injection 五味子醇甲 Schizandrin Spheri-5 RP-18 22cm×4.6mm i.d H2O/CH3OH (28∶72) UV254 　 92 心肌荣口服夜 Xinjirong oral-medication 芍药甙 Paeoniflorin RP-C18 25cm×4.6mm i.d (10μ) H2O/CH3OH (60∶40) UV230 　 93 当归散 Dang-Guei-San 芍药甙，黄芩甙，阿魏酸 Paeoniflorin, Baicalin, Ferulic acid Cosmosil 5C18-AR 0.03%H\-3PO\-4/ACN 梯度 Gradient UV245 　 94 东方煎剂（含葛根）Oriental pharmacetical decoctions containing Puerariae radix 葛根素，异黄酮苷元，异黄酮苷 Daidzin, Puerarin, Daidzein TSK gel ODS-120T 25cm×4.6mm i.d CH3OH/10mmol/L磷酸盐缓冲液phosphate buffer pH6.5含5mmol/L-(n-C7H15)4NBr （68∶32） UV250 50℃ 95 养阴清肺糖浆 Yangyinqinfei syrup 丹皮酚, 芍药甙, 苯甲酸钠 Paeonol, Paeoniflorin, Sodium benzoate Develosil ODS-7 30cm×4.6mm i.d ACN/H2O/HAc (43∶57∶2) for 1(16∶84∶1) for 2,3 UV254(1) UV236(2,3) 　 96 古汉养生精口服夜 Guhangyangshengjing oral liquid 淫羊藿甙 Icariin HPODS (5μ) 10cm×4.6mm i.d H2O/CH3OH (45∶55) UV270 36℃ 97 牛黄解毒片 Niuhuangjiedu tablets 黄芩苷, 番泻甙, 甘草酸 Baicaloin, Sennoside,Glycyrrhizin Inertsil ODS 25cm×4.6mm i.d (2.5μ) ACN(含0.1%HAc) 梯度　Gradient UV240-450 40℃ 98 灭澳灵糖衣片　Mieaoling tablet 靛蓝，靛玉红 Indigotin, Indirubin Shin-Pack CLC-ODS 15cm×6mm i.d H2O/CH3OH (20∶80) 546 　 99 芫花萜膜 Pellicle 芫花萜 Yuanhuacine Zorbax ODS 15cm×4.6mm i.d (5μ) H2O/CH3OH (12∶88) UV240 　 100 蜂皇浆冻干粉，蜂皇浆颗粒剂，双宝素口服夜 Royal jelly 10-羟基-2-癸烯酸 10-hydroxy-2-decenoic acid Spherisorb C18 25cm×4mm i.d (5μ) CH3OH/H2O/H3PO4 （45∶55∶0.5） UV210 　 101 　　样品制备在HPLC的生物样品分析中是关键性的一步，其主要目的是：（1）将待分析物与蛋白质分离；（2）去除影响分析物保留和定量准确度的干扰物质；（3）浓缩待分析物以提高检测的灵敏度和检测限。生物样品包括体液（血清、血浆、全血、尿等）、组织液和其它样品。经典的样品预处理方法包括蛋白质沉淀和萃取。液液萃取是最常用的样品预处理方法，它能起到样品净化（去除干扰化合物）和去除蛋白质（将分析物从蛋白质基质中分出）的双重作用。沉淀方法中，沉淀剂（有机改性剂、盐、酸，如：三氯乙酸、高氯酸、钨酸、偏磷酸）被加到样品中，通过离心将沉淀除去，此方法的缺点是大大增加了分析时间，同时由于分析物在沉积蛋白质上的吸附而降低了回收率〔29〕。在生物样品分析中，直接进样技术在节约时间和劳力方面显示出了相当大的优越性。现已有几种直接进样方法，如柱切换、直接进样固定相、胶束色谱等〔30〕。为了研究中药的药代动力学，Homma和Oka建立了一个测定尿样中厚朴、8,9-二羟基-二氢木兰醇、medicarpin、甘草素、黄芩甙元、 次黄芩素、木蝴蝶素A和二羟苯基羟基苯酮等8个组分的HPLC方法。样品经葡糖苷酸酶酶解后，分出亲油性组分, 在正相柱上鉴定厚朴，在反相柱上鉴定其它组分〔31〕。异钩藤碱是传统中药钩藤的主要生物碱，有降低血压等效应。黄等〔32〕用乙醚萃取兔血浆，在ODS 柱上，以甲醇-水（95∶5,V/V）为流动相，建立了兔血浆中异钩藤碱浓度的HPLC方法。血药浓度在0.016～16 mg/L 范围内呈线性关系，血浆最低检测浓度为0.016 mg/L，绝对回收率为80.5%～85.1%。另有报道〔33〕，分别用乙醚和氯仿-异丙醇（4∶1,V/V）处理人血清和尿液，HPLC分析，盐酸青藤碱在体内的药代动力学过程符合二室开放模型，体内消除符合一级动力学消除过程。叶等〔34〕开发了测定血浆、尿及各种组织液中的淫羊藿甙的HPLC方法，此方法用乙酸乙酯萃取样品，已用于淫羊藿甙的药代动力学研究。用乙醚萃取犬血浆、小鼠组织、体液中的紫杉醇，HPLC分析，获得了一些药代动力学参数〔35〕。 刘春丽(兰州大学化学系,兰州 730000) 刘满仓(兰州大学化学系,兰州 730000) 朱彭龄(兰州大学化学系,兰州 730000) References 　1，World 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