柱前手性衍生化—毛细管气相色谱测定大鼠肝微粒体中安非他明对映体*

    
(浙江医科大学药学院药分教研室　杭州　310031)
　　摘要　　采用柱前手性衍生化方法，氯仿为提取溶剂，以N-三氟乙酰基-脯氨酰氯［(S)-(-)-N-(Trifluoroacetyl)-prolylchloride,S-TFPC］为手性衍生化试剂，三乙胺为催化剂，将安非他明转变成相应的酰胺类非对映异构体对，用常规非手性毛细管柱气相色谱，程序升温法分离了大鼠肝微粒体中R-和S-安非他明，在5～250 μg/mL范围内线性良好，线性方程分别为：R-(-)-安非他明：Y＝6.92+62.18X，r=0.9988；S-(+)-安非他明：Y＝6.47+56.05X，r=0.9979。方法回收率±S：左旋安非他明(76.49 %±6.55)～(78.57 %±3.89)右旋安非他明为(73.15 %±4.19)～(75.78 %±1.97)。方法检测限为12.5 ng，定量限为125 ng(RSD＜11 %)。重现性和精密度均良好，相对标准偏差小于4.8 %。通过测定安非他明在大鼠肝微粒体中一相代谢时间反应曲线，表明安非他明在大鼠肝微粒体中经历了立体选择性代谢，左旋安非他明在大鼠肝微粒体中的代谢速率大于右旋安非他明。
关键词：安非他明对映体　手性衍生化试剂　立体选择性分析　气相色谱
　　安非他明(苯丙胺，Amphetamine,Amp)是一种间接作用的拟交感神经胺，从苯乙胺衍生而来。安非他明分子中含有不对称碳原子，通常是以外消旋体形式存在。安非他明的2个对映异构体有着不同的药效特性；其中，S-(+)-光学异构体对中枢神经系统的活性作用大约是R-(-)-光学异构体的3倍多，而对外周神经系统的作用只比R-(-)-光学异构体略小［1］。安非他明对映异构体各自的药理作用，药物代谢均不相同，有文献报道，安非他明药物动力学参数除了半衰期外，均有统计意义上的差异。为了进一步了解安非他明在大鼠肝微粒体中的代谢情况，我们采用了有机相衍生化技术，以N-三氟乙酰基-S-脯氨酰氯［(S)-(-)-N-(Trifluoroacetyl)-prolylchloride,S-TFPC］为手性衍生化试剂，将安非他明对映异构体转变成相应的酰胺类非对映异构体对［2，3］，于常规非手性毛细管气相色谱上建立了拆分安非他明对映异构体对的方法。本方法线性范围宽，检测限达12.5 ng，回收率良好，精密度较高。采用本文建立的方法测定了安非他明对映体在大鼠肝微粒体中的代谢消除速率，结果表明，安非他明Ⅰ相代谢具有立体选择性。
1　仪器与材料
1.1　仪器　GC—15A型气相色谱仪，装备有氢火焰检测器(日本岛津公司)C—R4A型色谱数据处理仪(日本岛津公司)HP —1　12 m×0.2 mm×0.3 μm交联甲基硅酮石英毛细管柱(美国惠普公司)HITACHI 80PT—7超速冷冻离心机(日本日立公司)Jouan MR 1822自动高速冷冻离心机(日本日立公司)AE—260型电子天平(瑞士METTLER公司)80—1型离心沉淀器(上海手术器械厂)21—6型恒温水浴槽(上海医疗器械厂)。
1.2　试剂　盐酸安非他明和S-硫酸甲基安非他明(内标IS)(国家麻醉品实验室)R-(-)-安非他明和S-(+)-硫酸安非他明(美国SIGMA公司)N-三氟乙酰基-脯氨酰氯(S-TFPC)(Aldrich Chem.Co.)三羟甲氨甲烷(Tris，上海化学试剂公司)异柠檬酸三钠盐，异柠檬酸脱氢酶，尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(辅酶Ⅱ，NADP)和氢化尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(还原型辅酶Ⅱ，NADPH)均购自美国SIGMA公司；其余试剂均为分析纯或色谱纯。
2　方法
2.1　安非他明提取和手性衍生化方法　精密量取大鼠肝微粒体10 mL，加40 %氢氧化钠1～2滴，调节pH至12～13，加入1 mg/mL S-甲基安非他明乙醇液100 μL为内标(IS)，混匀。加入氯仿2 mL，旋转振摇提取1 min，以4000 r/min离心10 min后，除去上层水层，下层用无水硫酸钠干燥，以4000 r/min离心10 min后，转移氯仿上清液至另一干净干燥具塞试管中，加入三乙胺催化剂10 μL，并加入S-TFPC液40 μL，旋转振摇使充分混匀后，室温振荡15 min使反应完全。加水2 mL洗涤使反应终止并洗去多余的衍生化试剂，吸去上层水层，于50 ℃水浴加热并吹气使挥干，残渣加入乙酸乙酯40 μL溶解，取样1 μL进行分析。
2.2　气相色谱分离条件　GC升温程序：100 ℃维持2 min，然后以10 ℃/min的速度升温至275 ℃，在275 ℃维持2 min。进样口温度：250 ℃；检测器温度：275 ℃；载气流速和压力：氢气压力：0.5 kg；空气压力：0.5 kg；氮气(载气)压力：1 kg；尾吹气流量：40～50 mL/min。分流比：1∶5。
3　结果与讨论
3.1　方法专属性和分离效率　由图1可见，空白微粒体样品对安非他明对映体及内标无干扰。经纯对映体验证，安非他明对映体和内标在色谱图上的位置与保留时间如图1所示。安非他明对映体在毛细管柱上的柱效和分离度见表1。
3.2　线性范围和灵敏度　分别吸取1 mg/mL安非他明外消旋体对照品乙醇溶液10、20、50、100、200、500 μL于各个具塞试管中，水浴挥干，分别加入空白大鼠肝微粒体1 mL(约含2 mg/mL蛋白质)和1 mg/mL内标100 μL。参照实验方法中“安非他明提取和手性衍生化方法”进行柱前衍生化，然后注射1 μL进入气相色谱仪进行分析，结果见表2。

图1　空白微粒体和空白加标准样品色谱图
实线为空白加标准样品　虚线为空白微粒体
1、2.杂质
3.R-(-)-安非他明(13.6 min)
4.S-(+)-安非他明(13.9 min)
5.S-(+)-甲基安非他明(内标，15.3 min)
表1　安非他明对映体的柱效和分离度

　R-(-)-Amp　S-(+)-Amp
理论板数314502　306632
分离度　2.00
α(t2/t1)　1.01

表2　R-(-)-安非他明和S-(-)-安非他明标准曲线

对映体浓度
/(μg/mL)(Y)峰面积比(X)
S-(+)-Amp与内标R-(-)-Amp与内标
50.06630.0597
100.11270.1060
250.26620.2447
500.60760.5820
1001.7811.486
2504.3243.929

　　R-(-)-Amp和S-(+)-Amp的线性回归方程分别如下：
Y＝6.92+62.18X　r=0.9988
Y＝6.47+56.05X　r=0.9979
实验结果表明，S-和R-Amp在5～250 μg/mL范围内线性良好。用逐步稀释法，测得安非他明对映体的检测限均为12.5 ng(信噪比S/N＞3)。定量限均为125 ng，RSD＜11 %。
3.3　回收率试验　分别吸取含2 mg/mL蛋白质的空白大鼠肝微粒体1 mL，加入1 mg/mL内标S-甲基安非他明100 μL，分别加入1 mg/mL安非他明外消旋体20 μL以及100 μL，混合均匀，参照实验方法中“安非他明提取和手性衍生化方法”进行柱前衍生化，然后注射1 μL进入气相色谱仪进行分析。按照下列公式计算方法回收率：
回收率(%)＝(AAmp/AIS)微粒体/(AAmp/AIS)水×100 ％
结果见表3。
表3　微粒体中安非他明对映体
测定的方法回收率(，n=6)

对映体浓度
/(μg/mL)回收率(%)
R-AmpS-Amp
10.076.49 %±6.5573.15 %±4.19
50.078.57 %±3.8975.78 %±1.97

3.4　重现性和精密度试验　分别吸取含有2 mg/mL蛋白质的空白大鼠肝微粒体1 mL，分别加入1 mg/mL安非他明外消旋体20 μL以及100 μL，混匀，加入1 mg/mL内标100 μL，混合均匀，按照实验方法中“安非他明提取和手性衍生化方法”进行柱前衍生化，然后注射1 μL进入气相色谱仪进行分析。计算分析方法的重现性和精密度，结果列于表4。结果表明，本方法的重现性和精密度良好，天内RSD小于4.8 %，天间RSD小于4.4 %。
3.5　安非他明在大鼠肝微粒体中的I相代谢反应　精密量取0.1 mol/L pH 7.4 Tris-HCl缓冲液8.5 mL，0.5 mol/L烟酰胺溶液1 mL，0.15 mol/L氯化镁溶液1 mL，在冰浴中，混匀。分别精密称取异柠檬酸三钠盐3.0 mg和异柠檬酸脱氢酶5.5 mg，在冰浴下加入上述配制的溶液中，使溶解完全。精密量取上述溶液9.71 mL，加入蛋白浓度为16.99 mg/mL的苯巴比妥诱导的大鼠肝微粒体1.29 mL，制成11 mL含2 mg/mL蛋白质的微粒体溶液，充氧气后，分别量取1.0 mL置于10支具塞试管中，于每支试管中分别加入浓度为1 mg/mL的安非他明外消旋体对照品溶液100 μL，混匀后，置恒温振荡水浴中37 ℃预孵育5 min，分别加入辅酶再生系统溶液(NADP 10 mg和NADPH 30 mg溶于新鲜配制的1 %的碳酸氢钠溶液配成100 μL)10 μL，于37 ℃下孵育，试管分别间隔5、10、20、40 min，按时取出，加入40 %的氢氧化钠溶液1～2滴，调节溶液pH至12～13以终止反应。分别加入1 mg/mL内标100 μL，按照实验方法中“安非他明提取和手性衍生化方法”进行柱前衍生化，然后注射1 μL进入气相色谱仪进行分析。 
表4　微粒体中安非他明对映体测定
的方法精密度(，n=5)

对映体浓度
/(μg/mL)测定浓度/(μg/mL)
R-(-)-Amp
(RSD，%)S-(+)-Amp
(RSD，%)
天内　109.865±0.33(3.3)9.886±0.19(1.9)
　　　5047.05±2.28(4.8)47.90±1.10(2.3)
天间　1010.54±0.38(3.6)10.42±0.38(3.6)
　　　5049.49±2.18(4.4)49.05±1.50(3.1)

　　安非他明各对映体经大鼠肝微粒体代谢后的剩余量列于表5。
安非他明对映体在大鼠微粒体中孵育后随时间代谢的速率和左旋与右旋安非他明的比率见表6。
手性药物作用于生物体，其对映体之间可具有不同的代谢机理和药理毒理作用［4～7］。目前，手性色谱法广泛用于手性药理学的研究［1，4］。本文采用柱前手性衍生化—毛细管气相色谱测定大鼠肝微粒体中安非他明对映体，结果安非他明对映体对在大鼠肝微粒体中经过孵育后的I相代谢时间反应曲线表明，毒性大的S-安非他明代谢较慢，毒性较小的R-安非他明代谢较快。反应时间从5 min到40 min，R与S-安非他明的浓度比从0.95减少到0.71，两者的代谢速率差异有增大趋势。可见，安非他明经大鼠肝微粒体的I相代谢具有立体选择性。 
表5　经大鼠肝微粒体代谢后R-(-)-Amp和S-(+)-Amp时间反应曲线(，n=4)

孵育时间
/minR-(-)-Amp/μgS-(+)-Amp/μg
反应剩余量反应量反应剩余量反应量
050.00　　　　0.00　　　50.000.00
544.14±1.475.86±0.2046.43±1.273.57±0.10
1037.63±0.5412.37±0.1845.60±0.564.40±0.05
2034.20±1.9215.80±0.8941.64±1.088.36±0.22
4023.36±1.5026.64±1.7232.78±0.8317.22±0.44

表6　R-(-)-Amp和S-(+)-Amp的
代谢速率和代谢比

代谢时间
/min代谢速率/(μg/min)两对映体
剩余量之比
R-(-)-AmpS-(+)-Amp
52.3421.4280.95
102.4740.8810.83
201.5800.8360.82
401.3320.8610.71


*国家自然科学基金资助项目
参考文献