气相色谱内标法测定蚕蛹油中α－亚麻酸含量

(解放军北京医学高等专科学校　北京100071)

　　摘要　　化学法提取的蚕蛹油经甲酯化后，采用气相色谱/质谱（GC/MS）技术，对蚕蛹油中脂肪酸的组分进行了分析，以十九烷酸（19∶0）甲酯作内标物，气相色谱法（GC）对蚕蛹油中α-亚麻酸进行了定量测定。结果表明蚕蛹油中α－亚麻酸的含量高达72.80 ％。本研究为α－亚麻酸的定量测定提供了实验依据。
关键词：气相色谱法（GC）　α－亚麻酸　蚕蛹　内标法　气相色谱/质谱(GC/MS)

　　蚕蛹为蚕蛾科昆虫家蚕蛾Bombyx mori的蛹，具有很高的营养价值^［1，2］。在医学上蚕蛹具有降低血胆固醇，治疗冠状动脉供血不足等效果^［3］。本文采用GC/MS法对蚕蛹油中的脂肪酸的组分进行了分析和鉴定，发现蚕蛹油中主要成分为α－亚麻酸(α-Linolenic acid，α-18∶3)，　并用气相色谱内标法对　其α－亚麻酸的含量进行了测定。
1　仪器与材料
美国PE公司气相色谱/质谱联用仪（Autosystem GC/Q-Mass 910型）和Autosystem XL气相色谱仪。NIST/EPA/NITH数据谱库。
蚕蛹购于辽宁凤城丝绸厂。
15种脂肪酸甲酯对照品为：肉豆蔻酸（14∶0）、软脂酸（16∶0）、硬脂酸（18∶0）、油酸（18∶1）、亚油酸（18∶2）、γ－亚麻酸（γ－18∶3）、α－亚麻酸（α－18∶3）、二十碳烷酸（20∶0）、二十碳一烯酸（20∶1）、二十碳二烯酸（20∶2）、二十碳三烯酸（20∶3）、　花生四烯酸（20∶4）、EPA（20∶5）　、DHA（22∶6）、十九烷酸（19∶0）；脂肪酸对照品1种(18∶2)。上述对照品纯度均≥99％，Sigma公司产品。
乙醚、石油醚、乙酸、正己烷、甲醇、三氟化硼、氢氧化钾、氯化钠等均为分析纯。
2　方法
2.1　样品的提取　将粉碎的蚕蛹80 g，置滤纸筒内于索式提取器中，用石油醚回流提取6 h^［4］，回收溶剂得到蚕蛹油。收率为16 %。
2.2　样品的甲酯化　蚕蛹油脂肪酸和脂肪酸对照品18∶2甲酯化参照王永奇等方法^［5］。用TLC法鉴定酯化结果，检测条件为：将酯化和未酯化样品（蚕蛹油脂肪酸和18∶2）1 mg/mL各取10 μL，点在硅胶板上，用石油醚—乙醚—乙酸（70∶30∶2）展开，用碘蒸气显色。结果：未酯化18∶2和蚕蛹油脂肪酸的R_f值各为0.487和0.447，酯化18∶2和蚕蛹油脂肪酸的R_f值分别为0.657和0.667，说明酯化较完全。
2.3　色谱分析条件
GC条件：Rtx－5空心石英毛细管柱（WCOT)，30 m×0.25 mm×0.25 μm；分流进样，分流比30∶1；载气为N₂，柱前压112 kPa；检测器为FID，空气39 kPa，氢气30 mL/min；进样口和检测器温度270 ℃；采用程序升温法：起始温度130 ℃，以10 ℃/min速率升温到185 ℃后，维持20 min,以5 ℃/min速率升温至220 ℃，再以10 ℃/min升至285 ℃，并维持该温度5 min。
GC/MS条件：载气为氦气，柱前压49 kPa，其它条件与GC相同。传输线温度250 ℃，离子源温度200 ℃，电离方式：EI,70 eV，质量扫描范围：20～380 a.m.u。
3　结果
3.1　蚕蛹油脂肪酸组分的GC/MS鉴定
以正己烷为溶剂，将甲酯化蚕蛹油脂肪酸配成10 μg/μL的样品液；另取14种脂肪酸甲酯对照品，用正己烷制备成标准混合液，各标准品浓度均为330 ng/μL。各取0.5 μL进样分析。
经气相色谱/质谱技术，以标准脂肪酸甲酯作对照，并检索NIST/EPA/NIH谱库，蚕蛹油中含9种脂肪酸，分别为肉豆蔻酸（14∶0）、棕榈油酸（16∶1）、软脂酸（16∶0）、十七烷酸（17∶0）、亚油酸（18∶2）、α－亚麻酸（α－18∶3）、硬脂酸（18∶0）、二十碳烷酸（20∶0）和二十二碳烷酸（22∶0），其中软脂酸（16∶0）、十七烷酸（17∶0）和二十二碳烷酸（22∶0）是根据谱库检索确定的。
3.2　GC内标法定量测定α－亚麻酸
3.2.1　确定内标　根据对照品和蚕蛹油脂肪酸甲酯的总离子流色谱图，蚕蛹油脂肪酸组分中不含十九烷酸（19∶0），并且十九烷酸（19∶0）与α－亚麻酸（α－18∶3）较接近，故选十九烷酸为内标，并将蚕蛹油脂肪酸与内标混合液分别进样，按GC条件进行分析，结果见图1和图2所示。

图1　蚕蛹油脂肪酸气相色谱图
1.十六烷酸(16∶0)　2.亚油酸(18∶2)
3.α-亚麻酸(α-18∶3)　4.硬脂酸(18∶0)
(注：括号内的比例数代表脂肪酸的碳原子数和双键数)

图2　蚕蛹油脂肪酸和内标气相色谱图
1.十六烷酸(16∶0)　2.亚油酸(18∶2)
3.α-亚麻酸(α-18∶3)
4.硬脂酸(18∶0)　5.十九烷酸(19∶0)

3.2.2　标准曲线制作　各取不同浓度梯度的α－亚麻酸标准液（0.25、0.5、1、2、4 μg/μL）与内标液（2 μg/μL）等比例混合，各取混合液1 μL，按GC条件进样测定。绘制标准曲线，在0.125～2.000 μg/μL范围内，呈良好线性。回归方程：
y=-0.0235+1.0541x　r²=0.9830
3.2.3　蚕蛹油中α－亚麻酸含量测定　取甲酯化蚕蛹油样品液（2 mg/mL）与内标液（2 mg/mL）等比例混合，取1 μL进样分析，样品测定3次求均值，α－亚麻酸在蚕蛹油中含量为72.80 %，RSD＝1.7 %。因为样品是经甲酯化后再进行色谱分析，在计算α－亚麻酸的实际含量时，要将α－亚麻酸甲酯乘以系数0.952，该系数是α－亚麻酸分子量与α－亚麻酸甲酯分子量之比。
4　讨论
气相色谱法分析蚕蛹油中脂肪酸的含量，存在一定的困难，主要是由于α－亚麻酸的含量较高，不易与其相邻峰达到基线分离。为了提高柱效，　改善分离度，能准确测　定α－亚麻酸的含量，我们用空心石英毛细管柱，固定相为5 %二苯基—95 ％二甲基聚硅氧烷，并采用程序升温的方法对蚕蛹油中的脂肪酸进行分离，分离效果良好。测定结果表明，蚕蛹油中α－亚麻酸的含量高达72.80 ％（RSD＝1.7 %）。

参考文献
1　　李永兴等.蚕蛹深度开发前景展望.湖南蚕桑，1994，(2):44
2　　赵全成等.柞蚕蛹化学成分的研究.中药通报，1987,12：38
3　　江苏新医学院主编.中药大辞典.第一版.上海：上海人民出版社,1977.1762
4　　张广强等.山茱萸核中脂肪酸的测定.中药材，1991，14(1):38
5　　王永奇等.紫苏研究Ⅺ.紫苏子的化学成分.中草药，1995，26:236

(本文于1997年9月22日收到)

Content Determination of α-Linolenic Acid in Can Yong Oil
by GC Internal Standard Method

Lu Ping,Lai Bingsen,Wang Yingqiang and Tan Yafang
(Department of Biochemistry,Beijing Medical College of PLA,Beijng，100071)
Yan Xaolin and Zheng Chenggui
(Laboratory of Chromatography,Beijing Medical College of PLA,Beijng,100071)

　　Abstract:Can Yong oil was extracted by chemical method.The fatty acid(FA)in Can Yong oil was saponificated by KOH-MeOH and was modified to methyl esters by means of BF₃-MeOH,and was checked with thin-layer chromatography.The compositions of fatty acids were analyzed by GC/MS.The method of GC internal quantification of α-Linolenic in Can Yong was established,using internal standard of C_19∶0.A linear relationship was obtained in the concentration rage of 0.125～2.000 μg/μL and the correlation coefficient was 0.9830.The content of α－Linolenic acid was 72.80 ％.The study may give a test method for determination of α-Linolenic.
　　Key words:gas chromatography,α-Linolenic acid,Can Yong,internal standard method,GC/MS