摘 要 建立了同时测定人血浆中异烟肼和吡嗪酰胺的反相高效液相色谱法。色谱柱Lichrospher 100 RP-C8(5 μm)，流动相为乙腈（A）∶0.05 mol/L磷酸二氢钾（B）（每500 ml中加入三乙胺约200 μl调pH 5.6），检测波长270 nm。线性范围分别为0.1～10 μg/ml和1～40 μg/ml，方法回收率分别为大于90%和82%，日内、日间差皆小于10%。
关键词 异烟肼； 吡嗪酰胺； 高效液相色谱法； 血药浓度； 含量测定
结核病的治疗当前多采用数种抗结核药联合应用的方法，特别是利福平、异烟肼和吡嗪酰胺联合应用于结核病短程化疗时加强期，对于缩短结核病的治疗时间，提高结核病的
临床治愈率，增加病人治疗的顺应性具有十分重要的意义［1］。有关利福平、异烟肼和吡嗪酰胺同时应用时，其体内药物浓度的测定，国内外基本上是将血浆样品分别测定三药的浓度［2～4］，本文采用梯度洗脱，三氯醋酸直接沉淀蛋白的方法，可以一次进样同时测定血浆中的异烟肼和吡嗪酰胺，内源性杂质和利福平不干扰两样品的测定，方法学考察适于人体内生物样品的分析，用于临床血药浓度监测和生物等效性评价。
1 实验部分
1.1 药品与试剂
异烟肼（标准品，西安有生药物研究所），吡嗪酰胺（标准品，中国药品生物制品检定所），甲醇（色谱纯），乙腈（色谱纯），磷酸二氢钾（分析纯），三乙胺（化学纯），三氯醋酸（化学纯），实验用水为新鲜双蒸水。
1.2 仪器
Metteler-AE240型电子天平（上海第一分析仪器厂）；PHS数字式pH计（上海理达仪器厂）；XW-80型旋涡混合器（上海第一医学院仪器厂）；80-2型离心机（上海
手术器械厂），电热恒温水浴锅（上海沪南科学仪器厂）；Hewlett-Packard高效液相色谱仪（含HP-1100系列四元梯度泵，HP-1100自动进样器，HP-1100二极管阵列检测器，HP化学工作站）。
1.3 血浆中异烟肼和吡嗪酰胺的高效液相色谱测定法
1.3.1 色谱条件 色谱柱：Lichrospher 100 RP-C8(5 μm， 250×4 mm)(HP公司）；流动相：乙腈（A）∶0.05 mol/L磷酸二氢钾（B）（500 ml加入三乙胺200 μl调pH 5.6）（梯度为1 min: A∶B为4∶96, 5 min: A∶B为6∶94, 10 min: A∶B为40∶60, 淋洗时间: 20 min, 冲洗时间: 5 min）；柱温：30℃；流速：1 ml/min；检测波长：270 nm。
1.3.2 血药浓度测定法 取血浆1 ml置离心管中，精密加入浓度为10 μg/ml的茶碱甲醇溶液10 μl，混匀，涡旋，加20%三氯醋酸（g/v）水溶液200 μl，涡旋1 min，4000 r/min离心5 min，精密吸取上层溶液30 μl，按上述色谱条件进样分析。
1.3.3 血浆中异烟肼和吡嗪酰胺标准曲线制备及最低检测浓度测定 取离心管数支精密加入不同量的利福平、异烟肼和吡嗪酰胺及空白血浆1 ml，配成分别含利福平的浓度为0.5,1,5,10,15和20 μg/ml、含异烟肼的浓度为0.1,0.2,1,3,5和10 μg/ml、含吡嗪酰胺的浓度为1,5,10,20,30和40 μg/ml的标准含药血浆，按“血药浓度测定法”项下操作，每种浓度做5份样品，记录峰面积。以样品与内标峰面积比值(Y)对浓度(C) 进行回归计算，结果表明异烟肼在0.1～10 μg/ml和吡嗪酰胺在1～40 μg/ml范围内线性良好，得回归方程分别为异烟肼：Y=0.21648C+0.00327，r=0.9993（n=5，图1）和吡嗪酰胺：Y=0.59984C+0.00493， r=0.9999（n=5，图1）。在上述条件下测得血浆中异烟肼最低检测浓度为0.1 μg/ml，吡嗪酰胺最低检测浓度为1 μg/ml (以信噪比= 3计)。
Fig 1. Relationship between concentration of pyrazinamide
and area-ratio in plasma(A) and relationship between concentration
of isoniazid and area-ratio in plasma(B)
1.3.4 方法的专属性 本实验条件下，异烟肼和吡嗪酰胺有对称的色谱峰和良好的分离度，血浆中杂质峰和利福平的峰（17.5 min）不干扰样品的测定。异烟肼及吡嗪酰胺的保留时间分别约为4.4 min、5.2 min，内标茶碱的保留时间约为12.6 min（图2），本方法具有较高的专属性。
Fig 2. Representative chromatogram showing the analysis for
isoniazid and pyrazinamide in human plasma
(A) blank human plasma, (B) standard plasma contained isoniazid
and pyrazinamide and theophylline (IS), (C) serum sample
1.3.5 方法的回收率 分别取异烟肼和吡嗪酰胺标准液适量于离心管中，配成浓度分别为0.1和1 μg/ml，3和10 μg/ml，10和40 μg/ml的异烟肼和吡嗪酰胺甲醇溶液，氮气流下吹干后，加入浓度为10μg/ml的茶碱甲醇溶液10 μl，混匀，吹去溶剂后，再分别取血浆1 ml加入离心管中，加入20%三氯醋酸溶液200 μl，涡旋30 s，4000 r/min离心5 min，将离心后的上层澄清液分别加入上述含异烟肼、吡嗪酰胺和茶碱的离心管中，涡旋混匀，取30 μl进样分析，分别计算异烟肼和吡嗪酰胺峰面积与内标的峰面积之比值（fs）。
取干净离心管数支精密加入不同量的异烟肼和吡嗪酰胺及空白血浆1 ml，配成浓度为0.1和1 μg/ml，3和10 μg/ml，10和40 μg/ml的标准含药血浆，每种浓度做5份样品，每份1 ml，加入浓度为10μg/ml的茶碱甲醇溶液10 μl，混匀，加入20%三氯醋酸溶液200 μl ，涡旋30 s，于4000r/min离心5 min，精密吸取上层溶液30 μl进样，计算异烟肼和吡嗪酰胺峰面积与内标的峰面积之比值(fx)。上述fx与fs的比值即血浆中异烟肼和吡嗪酰胺的提取回收率(R,％)， 回收率按下式计算，结果见表1、2。R(%)=fx/fs×100%
1.3.6 方法的精密度 取离心管数支，精密加入不同量的异烟肼和吡嗪酰胺及1 ml空白血浆，配成浓度为0.2和1 μg/ml，3和10 μg/ml，10和40 μg/ml的标准含药血浆，按“血药浓度测定方法”项下操作，每种浓度做5份样品，分别计算异烟肼、吡嗪酰胺和内标峰面积比。测定日内RSD和5 d内的日间RSD，结果见表3和表4。
1.3.7 人体内血药浓度测定试验 12名健康志愿受试者po 5片复方卫非特（含利福平120 mg、异烟肼80 mg和吡嗪酰胺250 mg）后异烟肼、吡嗪酰胺用上法测定的血药浓度-时间过程（图3）。
Fig 3. Mean plasma concentration-time curve of isoniazid(iso)
and pyrazinamide(pyz) for 12 subjects after a single oral dose
400mg isoniazid and 1250 mg pyrazinamide
—◆— Iso; —■— Pyz
2 讨论
利福平、异烟肼和吡嗪酰胺共存于血浆中时，因利福平是非极性药物，而异烟肼是极性药物,吡嗪酰胺是介于二者之间的两亲性药物。如果采用等梯度洗脱，溶剂系统极性强时，进样后利福平将无法洗脱，最终造成利福平对异烟肼和吡嗪酰胺测定的干扰，反之，异烟肼和吡嗪酰胺会干扰利福平的测定。为此，采用梯度洗脱的方法，分两次测定，一次单独测定利福平，另一次同时测定异烟肼和吡嗪酰胺。文献报道异烟肼和吡嗪酰胺分别测定，本文应用三氯醋酸作沉淀剂的蛋白沉淀法，一次进样同时测定异烟肼和吡嗪酰胺，方法简便，准确，血浆中利福平和杂质不干扰样品的测定，最低检测浓度分别达到0.1和1 μg/ml，回收率高于80％，日间和日内RSD小于10％，符合人体内生物样品的分析要求。
杨正管（南京军区福州总医院药理科， 福州 350025）
王庆彪（南京军区福州总医院药理科， 福州 350025）
刘莹（南京军区福州总医院药理科， 福州 350025）
参 考 文 献
作者：
杨正管,王庆彪,刘莹 2007-5-18