高效液相色谱法用于注射用穿琥宁及穿琥宁注射液含量测定的实验研究

高效液相色谱法用于注射用穿琥宁及穿琥宁注射液
含量测定的实验研究

杨水新　杨月春　张圣民

摘要　目的：测定注射用穿琥宁及穿琥宁注射液含量。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱为Shimpack CLC C18柱，流动相为 0.02 mol.L-1磷酸二氢钾(pH 3.0)-乙腈-甲醇(40∶10∶50)，流速1.2 mL.min -1，检测波长为251 nm。应用二级管阵列检测器对色谱峰纯度进行检验，以排除有关物 质的干扰。结果：平均回收率为99.88%，RSD为0.13%(n=3)。方法日 内RSD为0.99%(n=5)，日间RSD为1.2%(n=10)。结论：方法准确可靠，可作为该制剂的定量方法。 
关键词　脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯单钾盐　高效液相色谱

　　注射用穿琥宁及穿琥宁注射液为脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯(DAS)单钾盐制成 的冻干粉针剂及水溶液剂。临床用于病毒性肺炎，病毒性上呼吸道感染性菌痢等。文献［1，2］和生产厂家提供的质量标准［3］，均以分光光度法测定含量。本文应用高效液相色谱法对其含量的测定方法进 行了研究。并将测定结果与紫外分光光度法进行了对照。

1　仪器与试药

　　Waters高效液相色谱仪，Waters 996二极管阵列检测器，751-G分光光度计，Millennium 32 色谱管理系统。
　　脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯对照品(成都天台山制药有限公司提供，经峰面积归一化法测得 含量为99.63%)，脱水穿心莲内酯对照品(中国药品生物制品检定所)。乙腈、甲醇为色谱纯 ，磷酸二氢钾为分析纯。注射用穿琥宁［川卫药准字(1993)第009046号］、川琥宁注射液［ 川卫药准字(1995)第010971号］均为成都天台山制药有限公司产品。

2　方法与结果

2.1　色谱条件　色谱柱为Shimpack-CLC C18柱(　　)；流动相为0.02 mol*L-1磷酸二氢钾(pH 3.0)-乙腈-甲醇(40∶10∶5 0）；流速为1.2 mL*min-1；检测波长为251 nm；用于色谱峰纯度分析和光谱匹配 对照时，检测器扫描范围为220～300 nm，分辨率为1.2 nm，扫描速度为每秒1次。
2.2　标准曲线　精密称取脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯对照品40 mg ，置1 00 mL量瓶中，加甲醇50 mL使溶解，加水至刻度。分别进样4，8，12，16，20 μL，各2针 ，按上述色谱条件测定峰面积，对照品色谱图见图1-A。以平均峰面积A对相应进样量 m(ng)回归，得回归方程为：
A=842.3 m+35 741.5　r=0.999 8

图1　对照品(A)、样品(B)、样品加热后(C)色谱图
1.脱水穿心莲内酯　2.脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯
3，4.有关物质

2.3　精密度　取“2.6”项下供试品溶液，连续等量进样5次，隔日同 法测定，测得脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯峰面积日内RSD为0.99%(n=5)，日间RSD为 1.2%(n=10)。方法重现性和供试品稳定性均较好。
2.4　回收率　取批号为990201的粉针剂1瓶，精密加水5 mL溶解， 摇匀 。精密吸取1 mL，置100 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀。进样10 μL，2针。按回归方程计 算出含量。另分别精密称取脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯对照品8.9，11.2，9.5 mg，各置 10 0 mL量瓶中，加甲醇10 mL使溶解后，分别精密加入上述已测知含量的样品溶液(309.6 μg *mL-1)1 mL，加水至刻度，进样10 μL，3针。按回归方程计算结果。结果平均回 收率分别为99.75%，100.0%，99.90%；RSD分别为0.33%，0.13%，0.29%。
2.5　干扰试验　穿琥宁为酯类物质，在水溶液中易于分解氧化，因此选 用其注射液，对有关物质的干扰进行了研究。取批号为990504的穿琥宁注射液置80℃水浴中 ，放置4 d后取出，以“2.6”项下方法进样测定。以色谱管理软件中的色谱峰纯度分析和 光谱匹配对照软件包对所得色谱图进行分析。结果脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯峰的纯度角(P urity anglel)为0.270，阈值(Purity threshold)为0.359；光谱匹配角(Match anglel) 为 0.219，阈值(Match threshold)为1.113，在220～300 nm范围内与对照品差谱在-0.0002 ～0.0001之间，与其他色谱峰分离良好。色谱图见图1-C。
2.6　样品测定　取规格为40 mg粉针剂10支，内容物以水溶解并转 移至1 00 mL量瓶中，定容，并以水稀释成约400 μg*mL-1。取规格为200 mg：10 mL溶液 剂4支，内容物混匀后，精密吸取2 mL，置100 mL量瓶中，加水至刻度。取规格为200 mg粉 针剂5支。同前粉针剂处理。各进样10 μL，2针。以平均峰面积按回归方程计算结果。结果 与1.072相乘即为脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯单钾的含量，另参照厂方标准，以分光光度法 测定含量。结果见表1。样品(批号为990504)色谱图见图1-B。从含量测定结果可知，本法测 定结果显著低于厂方标准法，按厂方标准，其含量范围为标示量的85%～110%。依此判断， 厂方标准法结果均符合规定。而本法测定的结果则有2批不符合。从色谱图可知，不合格品 的峰1和峰2显著增高，两者的光谱图与脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯极为相似，但均未测到脱 水穿心莲内酯峰。

表1　样品测定结果(标示量%) 
 

批号 规格 本法 厂方标准 
980706 40 mg 91.98 91.86 
980701 40 mg 95.06 97.05 
980702 40 mg 90.56 98.36 
990504 200 mg:10 mL 81.61 90.99 
990201 200 mg 82.54 88.37 

3　讨论

3.1　流动相以酸性磷酸盐缓冲液代替水，起到离子抑制作用，可显著改 善分离效果。另加入适量乙腈，可使脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯的峰型尖锐，对称，测定 结果稳定。
3.2　干扰实验结果表明，穿琥宁注射液对热不稳定，80 ℃放置4 d后， 其含量下降为原含量的30%，从色谱图可知，多种降解物在251 nm均有吸收。因此，以紫外 分光光度法测定含量时，应注意有关物质对结果的影响。

杨水新（湖州市中心医院　浙江　313000）
杨月春（湖州市中心医院　浙江　313000）
张圣民（湖州市中心医院　浙江　313000）

参考文献
1，张志荣，廖工铁，王炳南等.脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯单钾盐在家 兔体内的药代动力学研究.华西药学杂志，1991，6(3)：129
2，王炳南，贺菊英，龙波等.穿琥宁注射液中DAS-K的含量测定和储存期的预测 .华西药学杂志，1999，14(2)：104
3，四川省药品标准.1992.282 

(本文于1999年7月13日收到)