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袁海龙*，李仙逸，张 纯，柳正良，郭 澄，林厚文
摘要 目的：建立超临界流体萃取(SFE)中药何首乌中的磷脂类成分的方法。方法：采用系统观察法考察了SFE的提取工艺,并用反相高效液相色谱法进行分离测定。结果：在SFE中，通过对萃取条件的考察，确定萃取压力为31.5 MPa,温度50℃,改性剂加入量0.6 mL.g-1,静态萃取时间5 min及动态萃取体积7 mL。在HPLC中,以Waters Symmetry C18为固定相,甲醇—1.0%磷酸溶液(90∶10)为流动相,检测波长206 nm。结论：SFE-HPLC法测定何首乌中的磷脂类成分，为何首乌及其制剂的质量控制提供依据。
关键词 超临界流体萃取；高效液相色谱法；何首乌；磷脂
何首乌为蓼科植物Polygonum multiflorum Thunb.的块根，为传统中药之一，有滋补强壮、解毒消痈、润肠通便等功效。何首乌所含的磷脂类是其重要的活性成分,在抗衰老、降血脂、防治心血管疾病等方面均有重要作用。已有作者报道用分光光度法［1～3］、薄层色谱法［4］等分析何首乌中的磷脂类成分，但预处理繁琐费时，提取效率不高，未见高效液相色谱法的分析报道。超临界流体萃取(supercritical fluid extraction, SFE)是近代分离领域出现的高新技术，除减少有机溶剂使用外，还有萃取效率和选择性高、省时、萃取溶媒便于挥发、提取物较为干净、环境污染小、操作条件易于改变等特点，是一种较为理想的萃取方法［5］。本文建立了SFE-HPLC法分离测定何首乌中的磷脂类成分，为何首乌及其制剂的质量控制提供方法学依据。
实验部分
1 仪器与试药
Waters 600液相色谱仪,Waters二极管阵列检测仪(美国Waters公司)ISCO 100注射泵,SFX-10超临界流体萃取仪(美国ISCO公司)HA-202M电子天平(日本)。
磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine, PC)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine, PE)、磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol, PI)及磷脂酸(phosphatidic acid, PA)对照品(美国Sigma公司提供)何首乌药材购于安徽亳州药材市场，由第二军医大学药学院生药教研室宓鹤鸣教授鉴定；甲醇为色谱纯;氯仿、磷酸为分析纯。
2 色谱条件
色谱柱为Waters Symmetry C18 5 μm (250 mm×4.6 mm)，流动相为甲醇—1%磷酸(90∶10),流速0.8 mL.min-1，室温,检测波长206 nm。
3 SFE条件的选择
3.1 改性剂的选择 超临界CO2流体的极性一般在正己烷和氯仿之间，因此在萃取极性成分时，一般要加入少量极性溶剂，以改善萃取效果。我们考察了甲醇、氯仿、乙酸乙酯和Folch试剂(氯仿—甲醇为2∶1)等4种溶剂，以Folch试剂萃取效率为最高，因此选择了Folch试剂作为改性剂。
3.2 萃取压强的选择 超临界流体具有很大的可压性，在一定温度下，压强增加，超临界流体的密度增加，溶质在流体中的溶解度增大，萃取效率提高。固定其他参数，改变压强从28～42 MPa，每隔3.5 MPa萃取一个点，结果见图1。从图可见，选择31.5 Mpa作萃取压强较好。
Fig 1 Effect of pressure on extraction efficiency.
○—○ Phosphatidylethanolamine (PE) ●—● Phosphatidylcholine (PC).
3.3 温度的选择 恒压下，温度升高，流体密度下降,但溶解度是溶质挥发度的函数，提高温度可指数级地提高溶质的蒸气压，从而增加溶质的溶解度，提高萃取效率。改变温度从40～70℃,每隔10℃萃取一个点，结果见图2。从图可见，选择萃取温度为50℃较好。
Fig 2 Effect of temperature on extraction efficiency.
○—○ PE; ●—● PC.
3.4 改性剂量的选择 加入一定量的极性改性剂可提高萃取量，但过高的改性剂量将使萃取状态在一种非临界状态下进行，往往达不到理想的萃取效果。我们试验了0.4,0.6,0.8,1.0 mL.g-1(相对于何首乌药材的取样量) 4种剂量，结果见图3。由图可见，0.6 mL.g-1 Folch试剂作为改性剂萃取效果良好。
Fig 3 Effect of modifier volume on extraction efficiency.
○—○ PE; ●—● PC.
3.5 静态萃取时间的选择 整个超临界流体萃取过程既包含转运，又存在扩散，保持一定的静态萃取时间，可提高萃取效率。我们试验了3,5,7 min 3种时间，结果见图4。由图可见，静态萃取时间5 min较好。
Fig 4 Effect of static extraction time on extraction efficiency.
○—○ PE; ●—● PC.
3.6 动态萃取体积的选择 动态萃取体积对萃取效率影响很大，固定其它4种萃取条件，改变萃取体积为3,5,7,9 mL，结果见图5。我们选择了7 mL为动态萃取体积。
Fig 5 Effect of dynamic extraction volume on extraction efficiency.
○—○ PE; ●—● PC.
4 标准曲线绘制
精密称取PE,PC对照品溶液(5 mg.mL-1) 2,8,12,16,20 μL,用流动相配制定容于1 mL量瓶中。每次进样20μL,按上述色谱条件测定峰面积。以峰面积积分值为纵坐标,对照品进样量为横坐标绘制标准曲线,在0.2～2.0 μg范围内线性关系良好。PE回归方程为:Y＝85395.45X+21870.88,γ=0.9991；PC回归方程为:Y＝76659.25X+1826.7,γ=0.9987。
5 精密度试验
取标准曲线项下对照品溶液,重复进样5次,每次20 μL,对照品峰面积积分值的RSD分别为PE 3.1%，PC 4.2%。
6 加样回收率试验
取已知含量的何首乌药材0.5 g,分别加入对照品溶液适量,挥干,按样品方法萃取及测定,取5次测定的平均值计算回收率,结果分别为PE 96.51%(RSD 2.8%),PC 97.24%(RSD 4.1%)。
7 样品测定
取何首乌药材粉末0.5 g,精密称定,以上述最佳萃取条件进行萃取,用流动相将萃取物溶解并定容10 mL,取20 μL直接进样，色谱图见图6。结果：何首乌药材中PE含量为0.192%，PC为0.198%。
Fig 6 Chromatogram of phospholipids (A) and sample (B. Polygonum multiflorum Thunb).
1. Phosphatidylethanolamine; 2. Phosphatidylcholine; 3. Phosphatidic acid;
4. Phosphatidylinositol.
讨论
SFE是近年发展起来的新技术，操作简便，只需把样品装入萃取池，加入改性剂后可自动进行萃取，整个过程20 min即可完成，而且萃取液无需过滤即可直接进样分析，萃取有一定的选择性，提取的杂质较少，对环境几无污染，特别是磷脂遇热不稳定,给传统的溶剂提取带来困难，SFE为遇热不稳定的中药有效成分提取提供了一种有效的方法。本文考察了超临界流体萃取法与文献报道［4］的提取方法的提取效率,结果超临界流体萃取法优于传统的溶剂提取法。
本文用HPLC法使PE和PC得到很好的分离并定量,在何首乌中,由于其它磷脂含量低而没有定量。磷脂属弱酸性成分,流动相呈弱酸性条件下其保留行为得到改善。本文考察了以0.8%，1.0%和1.2%磷酸对分离情况的影响,结果甲醇—1.0%磷酸溶液(90∶10)得到的峰形对称,分离效果良好。
*Tel:(010)63815065, Fax:(010)63815065
作者简介：袁海龙 男，29岁，药师
作者单位：袁海龙，柳正良 解放军302医院药学部，北京 100039；
李仙逸 解放军222医院药剂科，吉林 132011；
张 纯，郭 澄，林厚文 第二军医大学附属长征医院药材科，上海 200003