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［摘要］ 目的：建立用超临界流体萃取(SFE)技术和毛细管气相色谱(CGC)的联用技术测定中成药六应丸中主要成分冰片和丁香酚的含量的方法。方法：采用正交设计法考察了影响超临界流体萃取因素的主效应及最佳萃取条件，并以毛细管气相色谱法进行定量分析。结果：SFE的最佳萃取条件为：压力48.2 MPa，温度60 ℃，改性剂量0.2 ml，静态萃取时间10 min。结论：SFE-CGC法测定六应丸中冰片和丁香酚快速、简便、准确、灵敏。
［关键词］ 超临界流体萃取法；冰片；丁香酚；六应丸；毛细管气相色谱法；正交设计法
六应丸由冰片、公丁香、蟾酥、珍珠等组成，具有清热解毒、消炎退肿、止痛等功效，用于乳娥、疖痛疮疡、咽喉炎以及牙痛口疳等症。超临界流体萃取(SFE)技术具有传质速度快、萃取效率高、无毒、经济、操作简便、选择性好等优于传统溶剂萃取法的特点，特别适应于当前环保意识不断增强的国际大气候。然而，由于影响SFE的因素较多，摸索最佳萃取条件存在一定的困难［1］，我们利用正交设计首次对SFE萃取六应丸中冰片和丁香酚的萃取条件的选择进行了实验［2］，用方差分析法确定了主效应和次效应，摸索出了最佳萃取条件，并将SFE与传统的溶剂萃取法［3］进行了对比。
1 仪器与试药
DM 100注射泵，SFX 2-10萃取器(美国ISCO公司)，气相色谱仪HP-5890 Series Ⅱ，FID检测器，25 m×0.32 mm，0.52 μm，HP-5柱(crosslinked 5% Ph Me Silicone)。HP-3365化学工作站(美国Hewlett-Packard公司)。
冰片、丁香酚和麝香草酚(中国药品生物制品检定所)；六应丸(上海中药一厂)；甲醇、环己烷、氯仿、乙酸乙酯均为分析纯。
标准溶液：精密称取冰片和丁香酚适量，分别用乙酸乙酯配成5.22 mg.ml-1和4.87 mg.ml-1溶液，置4 ℃冰箱放置。
内标液配制：精密称取麝香草酚适量，用乙酸乙酯配成8.92 mg.ml-1溶液，置4 ℃冰箱放置。
2 样品分析
2.1 SFE萃取 精称粉碎后过100目筛的六应丸粉末100 mg置萃取池中，按最佳萃取条件操作，用适量乙酸乙酯吸收，精取内标0.5 ml，定容至10 ml，备用(提取液1)。
2.2 超声溶剂法萃取〔［3］ 精称上述粉末100 mg，加入适量乙酸乙酯，超声提取60 min，冷却后精确加入内标溶液0.5 ml，乙酸乙酯定容至10 ml量瓶中(提取液2)。
2.3 索氏提取法萃取 精称上述粉末0.5 g，置50 ml索氏提取器中，加乙酸乙酯75 ml，水浴加热提取6 h，过滤于100 ml量瓶中，用乙醇清洗残渣，精密取内标溶液5 ml，加乙酸乙酯至刻度备用(提取液3)。
2.4 色谱条件 气化温度250 ℃，检测器温度270 ℃，柱温160 ℃，载气N2，柱头压55 kPa，分流比100∶1，内标为麝香草酚，进样量1 μl。色谱图见图1～图3。
2.5 标准曲线制备 分取标准液0.1，0.2，0.4，0.8，1.2 ml于10 ml量瓶中，注入内标溶液0.5 ml，稀释至刻度，进行气相色谱分析。以峰面积比(Y)对含量(X)作回归计算，得回归方程：冰片Y=2.115X-9.928×10-3，r=0.9999，线性范围52.2～626.4 ng，丁香酚Y=2.153X+1.526×10-4，r=0.9999，线性范围48.7～584.4 ng。
2.6 含量测定 提取液1直接进样1 μl，提取液2、提取液3因杂质干扰较严重，均以氧化铝柱净化样品后再进样1 μl，结果见表1。
表1 不同提取方法的冰片、丁香酚的含量测定结果
提取方法 冰片
/mg.g-1 RSD
/% 丁香酚
/mg.g-1 RSD
/%
超临界流体萃取 33.74 2.56 40.67 2.23
超声波提取 27.91 2.63 30.84 2.14
索氏提取 28.43 2.47 32.77 3.32
注：n=3
2.7 SFE加样回收率试验 在药材中定量加入标准液0.8 ml，挥干，测定方法相同，测得加样回收率为冰片101.93%，RSD 1.56%(n=3)；丁香酚98.43%，RSD 2.26%(n=3)。
2.8 萃取条件的选择 采用正交设计法和方差分析，选正交设计表L9(34)，四因素为温度(A)、改性剂量(B)、压力(C)、静态萃取时间(D)，见表2。正交试验结果见表3。经极差分析，由冰片和丁香酚的极差来看，对萃取程度的影响次序依次为B，C，A，D，两者结果是一致的。此外对正交设计还进行了方差分析，见表4和表5。方差分析的结果显示了改性剂量对冰片和丁香酚的SFE影响特别显著，是影响SFE的主效应，对于冰片，压力影响显著，为次效应，温度具有一定的影响，静态萃取时间对SFE没有什么影响；而对于丁香酚，压力的影响显著，为次效应，而温度和静态萃取时间具有一定的影响。由于改性剂的加入量影响最大，我们又做了1份萃取条件为：A 60 ℃，B 0.3 ml，C 48.2 MPa，D 10 min，结果冰片和丁香酚的含量均和下列条件：A 60 ℃，B 0.2 ml，C 48.2 MPa，D 10 min的含量相近，且改性剂量加大后，在色谱中杂质峰也增加，因此，我们以后者作为最佳萃取条件。
2.9 改性剂的选择 固定萃取条件，分别以氯仿、乙酸乙酯、环己烷、甲醇为改性剂，以乙酸乙酯所得效率最高，本实验选择乙酸乙酯。
2.10 冰片对照品中龙脑、异龙脑的测定 冰片为龙脑和异龙脑的混合物，在柱温为160 ℃时，两者为
表2 L9(34)正交设计因素水平表
水平 A
温度
/℃
B
改性剂量
/ml C
压力
/MPa D
静态萃取时间
min
1 40 0.1 48.2 5
2 60 0 31.0 10
3 80 0.2 13.8 15
表3 正交实验设计结果
序号 峰面积比
冰片 丁香酚
1 0.57 0.59
2 0.41 0.43
3 0.60 0.62
4 0.64 0.68
5 0.36 0.35
6 0.83 0.89
7 0.57 0.58
8 0.50 0.48
9 0.69 0.71
表4 冰片方差分析表
变异来源 差方和 均方 F 临界值
温度(A) 0.0106 0.0053 3.161） F0.05(2，4)=6.94
改性剂(B) 0.1215 0.06075 36.263） F0.10(2，4)=4.32
压力(C) 0.0224 0.0112 6.682） F0.25(2，4)=2.00
时间(D) 0.0046
误差效应 0.0021 0.001675
注：①自由度均为2 1)因素对指标有一定影响 2)因素影响显著 3)因素影响特别显著(表5同)
表5 丁香酚方差分析表
变异来源 差方和 均方 F 临界值
温度(A) 0.0131 0.00655 5.951） F0.05(2，2)=19.00
改性剂(B) 0.1563 0.07815 71.043) F0.10(2，2)=9.00
压力(C) 0.0309 0.01545 14.042) F0.25(2，2)=3.00
时间(D) 0.0105 0.00525 4.771)
误差效应 0.0022 0.007875
一个峰，为了快速分析并使其与内标尽量靠近，作者以测二者的总量对冰片进行定量。龙脑和异龙脑在对照品中相对含量采用面积归一化法，色谱条件为把上述柱温改为90 ℃，其他条件不变，此时两者能够达到基线分离。结果为：异龙脑43.52%，RSD 0.67%(n=3)；龙脑54.85%，RSD 0.39%(n=3)。3 结论
SFE在萃取冰片和丁香酚时，萃取效率显著高于传统的溶剂萃取法，SFE操作简便，快速，整个过程仅需10几分钟；CO2价格低廉，且无毒，不可燃，化学惰性，易挥发；此外，SFE具有良好的选择性，在色谱过程中杂质干扰少，样品萃取后无须预处理可直接进样，节约了大量时间和精力，SFE在中药质量控制上具有广阔的应用前景。
［基金项目］国家自然科学基金资助项目(39770904)
陈斌(第二军医大学 药学院，上海 200433；)
方慧生(第二军医大学 药学院，上海 200433；)
杨根金(第二军医大学 药学院，上海 200433；)
吴玉田(第二军医大学 药学院，上海 200433；)
陈伟(中国人民解放军福州医学高等专科学校，福建 福州 350005)
［参考文献］
［1］Lou Xian-wen， Janssen Hans-Gans-Gerd, Cramers Carel A. Correlation of Supercritical -Fluid Extraction Recoveries with Supercritical-Fluid Chromatographic Retention Data： A Fundamental Study.J High Resolut Chromatogr.
1995，18(8)：483.
［2］郑用熙.分析化学中的数理统计方法.北京：科学出版社，1986.180.
［3］常丽萍，倪坤仪，王新堂，等，六应丸中冰片、丁香酚的毛细管气相色谱分析.中国药科大学学报，1989，20(5)：297.