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摘要：建立了用超临界流体从印楝种子中萃取印楝素的方法．用正交试验优化设计选择萃取条件，最佳萃取条件为：温度35℃，压力30MPa，夹带剂用量每克印楝种子干粉1.5mL甲醇．提取率明显优于溶剂法．
关键词：超临界CO2流体萃取；印楝种子；印楝素
印楝素(azadirachtin)是第一个从印楝Azadirachta indica种子中分离出来的、目前世界公认的活性最强的植物源昆虫拒食剂，对害虫具有显著的拒食和生长发育抑制作用．印楝素主要存在于印楝种子中，印楝种子中含印楝素可达0.1％～0.9％(w)．为了从印楝种子中充分提取印楝素，本文研究了用正交试验优化设计选择超临界流体从印楝种子中提取印楝素的最佳萃取条件．
1 材料与方法
1．1 材料
印楝种子产自缅甸，由成都绿金生物科技有限责任公司提供，粉碎．印楝素纯品(w为95％)，美国Sigma公司．
1．2 超临界CO2流体装置
1 L超临界CO2流体装置：华南理工大学汉维新型分离技术开发中心．
1．3 高效液相色谱仪
1100型高效液相色谱仪：美国惠普公司．
1．4 试验方法
1．4．1 超临界CO2流体萃取印楝素方法采用正交试验优化设计，预先确定温度、压力和夹带剂用量，向超临界萃取罐中加入一定量的印楝种子干粉，夹带剂提前12h左右加入印楝种子干粉中，并混合均匀．当达到预定条件后，开始计时，萃取2.5h．每处理重复3次，测量结果为3次重复的平均值．
1．4．2 常温冷浸提取印楝素方法 称取20g印楝种子干粉于三角瓶中，加入80mL甲醇，浸提48h，大约每6h震荡1次，减压浓缩，再加入80mL甲醇，冷浸48h，减压浓缩，如此3次，合并3次的提取物，称质量备用．每处理重复3次，测量结果为3次重复的平均值．
1．4．3 印楝素含量的定量分析方法参考何道航的高效液相色谱法，色谱条件为：流动相：V(乙腈)：V(水)=28：72；紫外检测器检测波长：217nm；色谱柱：Cl8柱；流速：1mL／min；进样量：10μl．
2 结果与分析
2．1 超临界CO2流体萃取结果
根据印楝素的特性，以甲醇作为夹带剂，选定3个不同的压力(10、20、30MPa)，3个不同的温度(35、45、55℃)和3个不同的夹带剂用量(100、200、300mL)，以影响印楝素萃取的3个因素变量(温度、压力和夹带剂用量)设计3因素3水平正交试验优化设计，以每克印楝种子可提取的印楝素质量作为考核指标，超临界C02流体萃取印楝素工艺参数的正交试验优化因素水平，正交试验优化设计方案和试验.
采用正交试验优化设计所得的试验结果统计分析，由表结果可知，温度、压力和夹带剂用量3个因素对印楝素萃取效果的影响为温度>压力>夹带剂用量．在最佳工艺条件AlB3C3即温度35℃ ，压力30MPa，夹带剂用量每克印楝种子干粉1.5 mL甲醇时，从每克印楝种子中可提取的印楝素的质量最高为3.436mg．
2．2 超临界CO2流体萃取与冷浸法萃取印楝素的结果比较
2种方法对印楝种子的提取率、提取物中印楝素的含量和从每克印楝种子中提取的印楝素的质量3个方面的差异进行了比较.
可以看出，超临界C02流体从印楝种子中萃取印楝素比冷浸法具有明显的优势．超临界C02流体萃取印楝素的提取物中印楝素的质量分数为6.004％，而常温冷浸法的提取物中印楝素的质量分数为1.318％，每克印楝种子用超临界CO2流体可提取3.436mg的印楝素，而常温冷浸法只能提取到2.453mg，前者比后者高出28.61％ ．
3 讨论与结论
温度对超临界CO2流体萃取印楝素的影响在3个条件中是最显著的．可能是由于印楝素是热敏物质，并且超临界中的压力远远大于常压，因而在温度和高压力的共同作用下，提取物中印楝素对热更不稳定，从而使每克印楝种子中提取到的印楝素随着温度的升高而下降．压力对超临界CO2流体萃取印楝素的影响也达到显著水平，随着压力的升高，本文得出的结论是更有利于印楝素的萃取，这与杨军等报道的随着压力的升高，其他杂质也一同大量萃出，从而造成提取物中印楝素含量和回收率明显下降的结论相佐，这可能是所采用的评价标准(杨军等的评价标准为提取物中印楝素含量和回收率之和)不同有关．但本研究得出的结论认为可以通过进一步处理除去萃取物中的杂质，所以不会降低萃取物中的印楝素含量．夹带剂用量对超临界CO2流体萃取印楝素的影响不显著．由于印楝素在甲醇中溶解度很大，所以超临界C02流体萃取只需少量夹带剂在高压状态下即可迅速富集有效成分，因此夹带剂用量对从每克印楝种子干粉中提取到的印楝素的质量的影响是不显著的．
通过比较可知，甲醇常温冷浸从印楝种子中提取印楝素是不完全的，所以用甲醇在常温下冷浸印楝种子提取印楝素是印楝素资源的一种浪费．
超临界C02流体萃取的效果也受到多种因素的影响，如萃取时间、C02的流量、原料的颗粒大小、水分含量、组分极性等．分离某种物质要进行反复探索性试验，才能获得最优的萃取条件，这也是技术的关键和难点所在．所以，随着超临界流体萃取技术的日益完善和广泛使用，可望利用超临界流体萃取技术从印楝种子中提取高含量印楝素提取物，为工业化利用超临界流体萃取技术从印楝种子中萃取印楝素提供理论依据．
参考文献：
[1] 徐汉虹．杀虫植物与植物性杀虫剂[M]．北京：中国农业出版社，2004．175—185．
[2] 何道航，徐汉虹，张志祥，等．0.3％印楝素乳油的高效液相色谱分析[J]．农药，2001，40(9)：18．