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【摘要】 目的：建立高效毛细管电泳测定赤土茯苓中赤土茯苓苷的方法。方法：采用胶束电动毛细管电泳法。运行缓冲液为44mmol/L1硼酸-19mmol/L 十二烷基硫酸钠(SDS)-6％ 甲醇(pH8．22)；操作电压20kV；检测波长208nm。结果：赤土茯苓苷在0．399～39．9μg/mL 范围内，浓度与峰面积呈良好的线形关系，r=0．9999。平均加样回收率为100．58％ 。测得赤土茯苓中赤土茯苓苷的含量为0．63％ 。结论：本法简便、快速、准确、灵敏，可用于赤土茯苓药材及制剂的含量测定及质量控制。
土茯苓为百合科菝葜属植物光叶菝葜(Smilax glabra Roxb)的干燥根茎。《本革纲目》始称“土茯苓有赤白两种，药用者白者良”，系对传统上中医用作解毒、除湿、利关节药而言。我们从赤土茯苓中提取、分离并鉴定出一单体黄酮苷类有效成分赤土茯苓苷(smiglabrin，Smi)，研究并发现了Smi对缺血心肌的保护作用和抗脂质过氧化作用。本研究应用高效毛细管电泳(HPCE)之胶束电动毛细管电泳法(MECC)测定赤土茯苓中Smi含量，以期为赤土茯苓药材及其制剂的质量控制提供快速、简便的方法和依据。
仪器与试药
Biofocus Capillary Electrophoresis System 3000型毛细管电泳仪(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)，紫外检测器；可装卸毛细管电泳柱套(Bio-Rad)；未涂层熔硅弹性石英毛细管柱(Bio-rad)，50μm (ID)×50cm，有效长度为柱长减去4．5cm；DELL OptiPlex GX110型微机；Biofocus op-erating software(Version 6．0)。Smi对照品(本室提取、分离、鉴定，纯度99％ 以上) ；赤土茯苓(广东高要)，实验用粉末过60目筛；甲醇为色谱纯；十二烷基硫酸钠(SDS，BDH Chemical Ltd．Poole England)，其他试剂均为AR 级。
方法与结果
1 毛细管柱的处理
1．1 新毛细管柱的预处理 开机后依次用0．5mol/L NaOH 冲洗20min，0．1mol/L NaOH 冲洗10min，超滤水冲洗10min，氮气吹干，备用。1．2 运行毛细管柱的处理 每次开机后依次用0．1mol/L NaOH冲洗10min，超滤水冲洗10min，运行缓冲液平衡20min；两样品测定间隔用运行缓冲液冲洗2min；测定样品完毕后依次用0．1mol/LNaOH冲洗2min，超滤水冲洗2min，氮气吹干，备用。
2 测定条件
根据Smi的化学结构及分子特性，首选了MECC。运行缓冲液为44mmol/L 硼酸-19mmol/L十二烷基硫酸钠(SDS)-6％ 甲醇(pH 8．22)；操作电压为20kV，极性由正到负，检测波长为208nm，柱温20℃ ，压力进样137．89kPa(20psi*sec)，运行缓冲液和样品测试液均经0．45μm 滤膜过滤，进样前离心脱气。
3 对照品储备液的制备
精密称取55℃ 真空干燥至恒重的Smi对照品0．0399g，置50mL量瓶中，加80％ 甲醇溶解并定容，即得39．9/mL 对照品储备液，0-4℃保存备用。4 标准曲线的制备精密吸取Smi对照品储备液一定量，用超滤水稀释成0．399，0．798，1．596，2．396，3．192，3．990，4．788，5．586，6．384，7．182，7．980，15．96，23．94，31．92和39．90μg/mL的浓度梯度对照品液。在“2项”的运行条件下，自动连续进样。以浓度(C，g·mL-1)对峰面积(A)进行线性回归，得回归方程：A =26 581．66C-7 916．46，r=0．9999。实验表明，Smi含量在0．399～39．9μg/mL范围内C与A 呈良好线性关系。
5 精密度考察
取浓度为5．0000和10．0000μg/mL的对照品溶液，在“2项”的运行条件下，日内每隔2h进样一次，日间每天进样一次，共测5次，测定峰面积和峰迁移时间，计算日内、日间RSD值。
6 回收率实验精密吸取已知浓度的供试液(3．1832μg/mL)250μL，精密定量加入Smi对照品溶液(39．9μg/mL )50μL，照供试液的制备及测定方法制备并测定。
7 供试液的制备与测定
取赤土茯苓干燥粉末约50mg，共5份，精密称定，分别置10mL量瓶中，加80％甲醇至刻度，超声40min，冷却，补充挥发的溶剂，离心，精密吸取上清液1mL于10mL 量瓶中，加超滤水至刻度。用0．45μm滤膜过滤后，在“2项”运行条件下进样，测定HPCE图谱。根据HPCE谱图积分所得峰面积，按标准曲线回归方程计算Smi含量，结果显示，赤土茯苓中Smi的平均含量为0．63％ ，RSD=0．76％ 。
讨 论
1 电泳模式的选择
MECC除了能分离离子化合物以外，还能分离不带电荷的中性化合物，Smi本身为弱极性近中性化合物，故选择MECC模式。
2 运行缓冲液的优化
2．1 缓冲体系的选择按照常规MECC方法，考察了硼砂-SDS、硼酸-SDS以及不同配比的磷酸盐一SDS缓冲体系，实验表明，硼酸-SDS缓冲体系分离度好。
2．2 pH值优化本研究考察了在pH7～9范围内缓冲液的不同pH 值对Smi峰形、迁移时间及分离度的影响。当运行缓冲液pH 为8．22时，Smi峰形好、分离度好。实验表明，当缓冲液浓度不变时，随着pH值增加，样品表面负电荷增加，受阳极的吸引力也增加，其迁移时间增加，但当pH 值过大时，由于碱性增强，石英毛细管的内壁表面积易受碱的损伤，重复性差；而pH 值过小时，峰形及分离度均变差。
2．3 缓冲液浓度 研究硼酸、甲醇和SDS三者不同浓度配比对分离效果的影响，进行了四因素、三水平L9(3 )正交试验，结果发现本研究采用的缓冲体系44mmol/L硼酸-19mmol/L SDS-6％ 甲醇(pH8．22)的分离效果最佳。甲醇在缓冲体系中起着有机添加剂的作用，在低浓度时，有助于Smi峰与其他峰的分开，峰形较好；在较高浓度时，能明显增加迁移时间。一定浓度的甲醇有助于稳定电渗流，提高分离测定的重现性，短链醇如甲醇等在低浓度时降低临界胶束浓度(CMC)，增强胶束形成；高浓度时，增加CMC，阻碍胶束形成。
2．4 电压的选择实验中比较了运行电压10，15，18，20，22，25kV 对Smi分离效果的影响。升高运行电压可以加快分析速度，一定范围内提高电泳分离效能。当电压升高到25kV 时，峰迁移速度过快，分离度下降；当操作电压降低到10kV 时，迁移时间过长。考虑到仪器寿命、分离度及迁移时间等综合因素，本实验选择操作电压为20kV。
综上所述，利用HPCE测定赤土茯苓中Smi含量，具有样品处理简单、操作简便、分析快速、灵敏度高等特点，适用于赤土茯苓药材及其制剂的含量测定及质量控制，也可用于Smi体内药物浓度分析和药动学研究。
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