高效液相色谱法测定小春花口服液木犀草素含量

【摘要】小春花为阴地蕨科植物阴地蕨Sceptridium ternatum(Thunb。)Lyon的带根全草，为福建民间习用草药，性味甘平，味淡，具有平肝、清热、镇咳和清火、明目、解毒祛风的功效[12]。小春花口服液(小伏口服液)是依据民间经验由小春花等药物组成的复方制剂，具有清肝解热、散风解毒的功效，实验表明该制剂有抗炎、免疫调节等作用[34]，临床用于治疗呼吸系统疾病。本文对服液主要有效成分木犀草素进行定性及含量测定，建立该制剂的质量控制标准。
【关键词】木犀草素
    1、材料与方法
    1.1材料
    1.1.1仪器高效液相色谱色谱仪(Focus型，美国光谱物理公司)紫外可见分光光度计(TU1221型，北京普析通用仪器有限公司)，离心机(ABBOTT，美国雅培仪器公司)，电子天平[(AE240型，Mettler仪器(上海)有限公司]，电热恒温干燥箱(GZXDH4045S，上海跃进医疗器械厂)，三用紫外分析仪(ZFI型，上海顾村电光仪器厂)，硅胶板(100 mm×200 mm，青岛海洋化工厂分厂)。
    1.1.2试药小春花及小春花口服液由福建省立医院药剂科提供。水为重蒸馏水：乙酸乙酯、苯、甲酸、磷酸、甲醇、石油醚、无水乙醇均为分析纯。对照品为木犀草素标准品(中国药品生物制品检定所，批号111520200201)。
    1.2方法
    1.2.1样品制备(1)称取干燥粉碎小春花5 g于索氏提取器中，加石油醚(60~90 ℃)100 mL，回流提取至石油醚无色，取出晾干。加无水乙醇100 mL，回流提取7 h，提取液加无水乙醇定容至50 mL作为供试品。(2)取木犀草素标准品适量，精密称定，加乙醇溶解，配成1 mg/mL木犀草素对照品。
    1.2.2有效成分薄层色谱鉴别硅胶G0。5%CMCNa板10 cm×20 cm，105 ℃活化1 h，展开剂:苯乙酸乙酯甲酸(8∶2∶0。5)。将供试品与对照品点于同一薄层板上，展开，晾干，三用紫外分析仪下(254 nm)观察供试品与对照品。对应位置均呈较明显的暗斑，表明供试品中含木犀草素(图1)。
    1.2.3木犀草素含量测定(反相高效液相色谱法)
    1.2.3.1色谱条件色谱柱为YWG C18ODS柱(250 mm×4。6 mm，5 μm)：流动相由0。4%磷酸缓冲液(pH 3)甲醇(50∶50)组成，流速1 mL/min，柱温25 ℃，进样量10 μL，紫外检测波长355 nm 。木犀草素峰保留时间约15 min。精密称取木犀草素标准品适量，配制成浓度为35 μg/mL甲醇溶液，分别取1。0，1。5，2。0，2。5，3。0 mL，用甲醇定容至25 mL，进样(10 μL)得色谱图，绘制标准曲线(图2)。
    1.2.3.2色谱和光谱鉴别取供试品2 mL，10 000 r/min离心10 min，上清液用微孔滤膜(0。45 μm)滤过，取续滤液10 μL进样，供试品色谱图保留时间约15 min处可见木犀草素峰，并与供试品中其他成分色谱峰较好分离。分别取5批次本院生产的小春花口服液2 mL，10 000 r/min离心20 min：上清液用微孔滤膜(0。45 μm)加压滤过，续滤液10 μL进样，依上述色谱条件作色谱图(图3)。
    2、结果
    2.1木犀草素标准曲线以木犀草素浓度(X)作为横坐标，其色谱峰面积(Y)作为纵坐标进行线性回归。结果回归方程为:Y＝35 771。18X2 214。22，r=0。999 3。木犀草素在14。32~43。42 μg/mL范围内符合比耳定律，线性关系良好。
    2.2测定方法的精密度与回收率日间分别配制5批次浓度为14。32 μg/mL和35。80 μg/mL木犀草素样品，依上法测定，日间变异为2。68%和2。09%，样品回收率为99。83%和98。66%(表1)。
    2.3小春花口服液木犀草素含量测定5批次本院生产的小春花口服液含木犀草素的浓度分别为16。38，17。39，17。43，17。05和16。13 μg/mL，平均为(16。88±0。53)μg/mL。表1木犀草素样品的日间变异和回收率
    2.4木犀草素标准品及小春花口服液样品分别放置1，3，5，7 d后测定峰面积值，基本无变化，说明标准品及样品相当稳定。
    3、讨论
    3.1小春花的主要化学分为黄酮类、阴地蕨素、槲皮素等。叶的浸出成分水解后含木犀草素[1]。小春花口服液(小伏口服液)是由小春花等药物以60%乙醇水加热提取数小时后浓缩去乙醇而进一步配制成的复方制剂。小春花口服液保留约15 min处色谱峰的紫外光谱，与木犀草素对照品在同一保留时间处色谱峰的紫外光谱均在200~400 nm，并与文献[5]的光谱峰位置一致。通过对小春花口服液进行薄层层析及高效液相色谱和光谱特征分析，笔者证实小春花口服液含木犀草素，后者含量可作为该制剂提取制备工艺的客观指标。
    3.2小春花口服液中木犀草素在上述色谱分离条件下，与其他成分色谱峰基本分离。以木犀草素计理论塔板数不低于6 000，口服液中其他成分在上述色谱分离条件下不干扰测定结果。运用高效液相色谱法测定小春花口服液中木犀草素含量，分离度好，快速准确，为全面客观地建立小春花口服液质量标准提供了依据。
【参考文献】
[1]中华本草编委会。 中华本草(精选本)[M]。 上海:上海科学技术出版社， 1998:207210。
[2]江苏新医学院。 中药大辞典[M]。 上海:上海科学技术出版社， 1995:980981。
[3]王少明，阮君山，庄捷。 小春花口服液对慢性支气管炎模型小鼠病理形式影响及祛痰作用[J]。福建中医药， 2001，32(3):1819。
[4]王少明，庄捷，阮君山。 小伏口服液的免疫学作用研究[J]。 福建医药杂志， 2001，23(2):102104。
[5]孙文基。 天然药物成分提取分离与制备[M]。 北京:中国医药科技出版社， 1999:243246。