高效液相色谱法测定三金胶囊中积雪草苷的含量

【摘要】  目的 建立测定三金胶囊中积雪草苷的高效液相色谱法（HPLC）含量分析方法。方法 以C18柱，乙腈水为流动相，采用梯度洗脱，流速为1.0 ml/min，检测波长205 nm。结果 积雪草苷的峰与其他色谱峰分离良好，在0.0338～0.5408 mg/ml范围内线性良好，回归方程为y=2×106x+1704.7（r=1），平均回收率为98.63%；RSD=0.76%（n=5）。结论 该方法简便，结果准确，适用于三金胶囊质量的控制。 

【关键词】  高效液相法 梯度洗脱 三金胶囊 积雪草苷

    ［Abstract］  Objective  To establish a method which can determine the asiaticoside in Sanjin softgelatin capsule.Methods  Using C18 reversedphase column，mobile phase as acetonitrilewater with gradient elution，the velocity of flow was 1.0 ml/min，detection wavelength was at 205 nm.Results  Asiaticoside was separated well from other ingredients.It showed a good linear curve in the range of 0.0338~0.5408 mg/ml，y=2×106x+1704.7（r=1），the average recovery rate was 98.63%（RSD=0.76%）.Conclusion  The method was simple and accurate for quality control of the Sanjin softgelatin capsule.

    ［Key words］  HPLC；gradient elution；Sanjin softgelatin capsule；assiaticoside

    三金胶囊是由胶囊剂改良剂型为软胶囊而来，系由金樱根、积雪草等五味中药材组成。本品具有清热解毒，利湿通淋，益肾之功效，用于下焦湿热，热淋，小便短赤，淋沥涩痛，急、慢性肾盂肾炎、膀胱炎、尿路感染属肾虚湿热下注证等。而且软胶囊较原剂型具有生物利用度高，密封性好，含量准确，外形美观等优点［1，2］。积雪草苷含量测定有滴定分析法、薄层扫描法和高速逆流分配法等，但这些方法操作复杂，且误差也较大，采用高效液相色谱法更适合于本品的质控［3，4］。由于本品的成分复杂，对测定有干扰，实验证明用HPLC梯度法测定三金胶囊中积雪草苷简便、快速、准确、可靠。

    1  仪器和试药

    Laballiance高效液相色谱仪，Shimadzu UV2100紫外可见分光光度计，Sartorius电子天平；三金胶囊（由广西药物研究所提供）；积雪草苷对照品购自中国药品生物制品检定所（批号：892200102）；乙腈为色谱纯，水为双蒸水，其他试剂均为分析纯。

    2  色谱条件

    色谱柱：Kromasil C18（4.6 mm×250 mm）；流动相：乙腈水梯度洗脱，程序见表1；柱温：25 ℃；流

    速：1.0 ml/min；检测波长：205 nm；进样量：20 μl。表1  乙腈水梯度洗脱程序

    3  方法和结果

    3.1  标准曲线的制备  精密称取积雪草苷对照品16.90 mg，置于25 ml量瓶中，用甲醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为标准储备液。分别精密量取储备液0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 ml于10 ml量瓶中，用甲醇溶液稀释至刻度，配成浓度为0.0338、0.0676、0.1352、0.2704、0.5408 mg/ml的标准溶液。分别吸取上述不同浓度标准溶液20 μl，依2项色谱条件进样测定，见表2。表2  积雪草苷对照溶液浓度与对应的峰面积由图1可知：积雪草苷在浓度为0.0338～0.5408 mg/ml范围内时，浓度与积雪草苷峰面积呈良好的线性关系。
 3.2  对照品溶液及供试品的配制

    3.2.1  对照品溶液的制备  精密称取积雪草苷对照品适量，加甲醇制成每1 ml各含50 μg的溶液，即得（图2）。

    图2  积雪草苷对照品HPLC色谱图

    3.2.2  供试品溶液的制备  精密称取本品内容物2.0 g，精密加入甲醇50 ml，称定重量，置于水浴上加热回流45 min，放冷，称定重量，用甲醇补足减失的量，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密吸取续滤液25 ml，蒸干，残渣使用0.05 mol/L氢氧化钠溶液30 ml，溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20 ml，弃去水层，合并正丁醇层，用正丁醇饱和的水溶液洗涤2次，每次10 ml，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加适量甲醇使溶解，转移至10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得（图3）。

    图3  三金胶囊样品HPLC色谱图

    3.3  干扰实验  取无积雪草的阴性样品，按3.2.1项下的方法提取，测定。结果在积雪草苷相应的保留时间无吸收峰，表明处方中其他成分对测定无影响（图4）。

    图4  积雪草阴性样品HPLC色谱图

    3.4  精密度试验  在2项色谱条件下，取3.1项下对照品溶液（0.2704 mg/ml）连续测定5次，结果见表3。实验证明，本法的精密度良好。表3  精密度试验结果

    3.5  重复性试验  对同一供试品溶液（20051115批），在2项色谱条件下平行测定5份，5份的平均值为519264，RSD=0.76%（n=5），见表4。实验证明，本法的重复性良好。表4  重复性实验结果

    3.6  加样回收率实验  精密称取已知含量为1.642 mg/g的三金胶囊（20051115批）内容物约1.2 g，共5份，分别精确加0.9480 mg/ml积雪草苷对照品溶液2.0 ml，按3.2.1项下方法提取，测定，计算回收率，结果积雪草苷的平均回收率为98.63%，RSD=0.76%（n=5），符合定量分析的要求，见表5。

    3.7  样品测定  在2项下的色谱条件下，本品3批样品中的积雪草苷含量，见表6。结果为3批样品每粒的平均含量为1.047，根据平均含量的80%拟定该产品的最
低含量限度为0.80 mg/粒。表5  积雪草苷回收率测定结果表6  样品测定结果

    4  讨论

    4.1  检测波长  积雪草苷紫外吸收很弱，仅在近紫外区有末端吸收，故流动相有机溶剂选择本底紫外

    吸收相对较弱的乙腈。对积雪草苷标准品溶液在190～400 nm进行紫外扫描，其最大吸收峰在197 nm处。但检测波长低于200 nm，溶剂本身的吸收以及噪音的影响也会加大，综合考虑，以205 nm作为检测波长。实验表明在2项下的色谱条件下，检测波长选在205 nm，检测灵敏度能达到令人满意的结果，且结果稳定可靠。

    4.2  洗脱程序  积雪草中成分很多，积雪草苷为三糖苷，极性较大。梯度洗脱时流速过高或流动相中乙腈比例上升过快均会使分离度不佳，因此流动相中乙腈的比例应该是缓慢地上升，经多次实验，确定了1.0 ml/min的流速及2项下的洗脱程序，积雪草苷峰分离较好且峰形良好。

    本文实验结果表明，采用高效液相色谱方法，能方便准确的测定三金胶囊中有效成分积雪草苷的含量，适用于该制剂的质量控制。
【参考文献】
  1 黄敏，张钧寿，谢跃进.软胶囊剂稳定性研究进展.中国医药工业杂志，2000，31（3）：137139.

2 陈健，张兆宸.软胶囊剂的发展和应用.天津药学，1996，8（4）：3234.

3 陈瑶，秦路平，郑汉臣，等.RPHPLC测定积雪草中积雪草甙、羟基积雪草甙的含量.中成药，2000，22（3）：227.

4 曾建国，宋云飞.HPLC法测定积雪草中三萜类化合物的含量.基层中药杂志，2000，14（6）：7.