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摘 要 本研究采用了高效液相色谱串联质谱联用（HPLCMS/MS）技术，建立了高灵敏度的同时检测粮谷中9种氨基甲酸酯类农药残留量的方法。样品经乙腈提取，中性氧化铝填充柱净化，然后采用HPLCESI(+)MS/MS测定。对液质分离条件和样品前处理条件进行了优化。9种氨基甲酸酯类农药在0.1～100 μg/L范围内线性良好，相关系数为0.9986~0.9998。在0.001～0.05 mg/kg浓度范围内，平均加标回收率在73.40%～102.01%之间；相对标准偏差为1.25%～9.94%。该方法简便、快速、灵敏、净化效果好。可同时满足进、出口粮谷中多种氨基甲酸酯类农药残留量的检验工作需要。
关键词 多残留分析，氨基甲酸酯类，粮谷，高效液相色谱串联质谱
1 引 言
氨基甲酸酯类农药是一类广谱杀虫剂，是以甲酸酯为前体化合物发展而来的，具有分解快、残留期短、高效、选择性强等特点。20世纪70年代以来，由于有机氯农药相继被不同国家禁用或者限制使用，以及抗有机磷农药的昆虫品种的日益增多，氨基甲酸酯类农药的使用量逐年增加。随着甲酸酯类杀虫剂使用量及范围的扩大，其在作物中的残留以及对人类健康和环境造成的毒害也越来越为人们所关注。鉴于此，国际上先后制定了谷物中多种氨基甲酸酯类农药的最高残留限量[１]（MRL）。日本政府规定进口大米中的MRL为：恶虫威、异丙威分别为0.5 mg/kg，抗蚜威、甲硫威分别为0.05 mg/kg，仲丁威为0.3 mg/kg。这些规定使我国粮谷出口面临越来越多的技术壁垒。因此，建立一种分析粮谷中氨基甲酸酯类农药残留量的简便、快速、高灵敏度的检测方法十分紧迫。目前，对氨基甲酸酯类杀虫剂残留分析的报道有水体、水果和蔬菜中气相色谱质谱（GCMS）、高效液相色谱（HPLC）、高效液相色谱质谱（HPLCMS）分析等[２～７]。由于该类化合物极性强，热稳定性较差，有些物质在气相色谱分析的温度下发生分解，用GC或GCMS并不理想；尽管HPLC紫外、HPLC荧光检测已经被广泛用于检测氨基甲酸酯类农药，但灵敏度尚无法满足实际样品分析的需要。液相色谱串联质谱法的检出限低、选择性强。目前运用LCMS/MS法检测氨基甲酸酯，国外报道有蔬菜和水果、果汁和酒以及柑桔中的多种氨基甲酸酯的检测[８，9]，本实验研究了粮谷中甲硫威、硫双灭多威、抗蚜威等9种氨基甲酸酯类农药残留分析的样品前处理方法和液质联用分离检测条件。结果表明，本方法简便、灵敏高、净化效果好，可满足进出口粮谷中多种氨基甲酸酯类农药残留量的检验工作需要。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂API 4000四极杆串联质谱仪（美国ABI公司）；1100系列高效液相色谱仪（美国Agilent公司）。农药标准品（Dr.Ehrenstorfer Co.，Germany）。乙腈、甲醇、丙酮、乙醚均为色谱纯（TEDIA，USA）；标准溶液：甲醇配制标准储备液（200 mg/L），根据检测要求用流动相稀释成相应的标准工作溶液。水为超纯水。
2.2 样品的提取和净化称取2.00 g磨碎的小麦粉置于80 mL烧杯中，加6 mL水润湿样品，20 min后加入20 mL乙腈，均质1 min（16000 r/min）后，过滤到50 mL离心管中，离心管底部放有约5 g NaCl（盐的加入有利于乙腈与水的分离），收集滤液后盖上塞子，涡旋1 min，静置片刻，离心2 min（4000 r/min），使乙腈层与水层分离，转移上层乙腈层溶液到100 mL烧瓶中。再加10 mL乙腈到离心管中，重复提取一次，合并乙腈层，40℃水浴浓缩近干。残渣用3 mL丙酮乙醚（20∶80，Ｖ／Ｖ）溶解，待净化。将上述溶液转移到中性氧化铝层析柱(先在柱底填少许脱脂棉，然后装入约2 cm高无水硫酸钠，再将10 g 5％水脱活过的中性氧化铝倒入装有20 mL乙醚的烧杯中，搅拌使其分散均匀，然后湿法装入柱中，最后在上面再填约2 cm高的无水硫酸钠)，用10 mL丙酮乙醚（20∶80，Ｖ／Ｖ）分３次洗涤残渣，上柱，最后用80 mL丙酮乙醚（20∶80，Ｖ／Ｖ）洗脱。洗脱液在旋转蒸发仪上30℃、以60 r/min减压浓缩至干，用流动相定容到2 mL，待测定。
2.3 色谱条件色谱柱：ZORBAX Eclipse XDBC8(150 mm×4.6 mm i.d.，美国Agilent 公司)；流动相：甲醇醋酸铵溶液（5 mmol/L），梯度洗脱程序表见表1；流速：0.3 mL/min ；柱温：20℃；进样量：20 μL。
2.4 质谱条件电喷雾离子源，正离子扫描方式，多反应监测，电喷雾电压5250 V，离子源温度400℃；雾化气流速：55 L/min、30 L/min（两路）；气帘气流速：３５
表1 流动相梯度洗脱程序 略
碰撞气流速：5 L/min；驻留时间：50 ms；定性离子对、定量离子对、去簇电压和碰撞气能量见表２。
表2 9种氨基甲酸酯类农药的质谱检测条件 略
3 结果与讨论
3.1 LCMS/MS分离条件的选择 在已有的文献报道中，氨基甲酸酯类农药的分离多采用C18或C8色谱柱，本实验采用Agilent 公司的ZORBAX Eclipse XDB系列C8柱。实验中研究了不同配比的乙腈NH4Ac溶液（5 mmol/L）、甲醇NH4Ac溶液（5 mmol/L）及乙腈乙酸溶液（2％），结果发现：不同体系的流动相对待测物的离子化产生较大的影响。乙腈乙酸溶液体系对甲萘威影响较大，甲萘威峰形很差；在乙腈NH4Ac溶液体系中仲丁威和甲硫威的峰高明显降低，并且通过调节乙腈的浓度，9种氨基甲酸酯分离效果仍不如甲醇NH4Ac溶液体系，故实验选择了甲醇NH4Ac溶液作为流动相。梯度洗脱程序见表1。实验中试验了不同的梯度程序，恶虫威和克百威（3号峰和4号峰）始终未能得到有效分离，但由于采用了选择离子对可避免相互干扰，不影响定性和定量测定结果。对各项质谱条件进行了优化（见表2），使各被测物的响应值达到最佳。图1为9种氨基甲酸酯农药混合标准溶液的色谱图。 图1 9种氨基甲酸酯农药混标(1.0 μg/L)的色谱图
Fig.1 Extract ion chromatogram of 9 carbamate pesticides standards (1.0 μg/L)
1. 灭多威(methomyl); 2. 硫双灭多威(thiodicarb); 3. 恶虫威(bendiocarb); 4. 克百威(carbofuran); 5. 甲萘威(carbaryl); 6. 抗蚜威(pirimicarb); 7. 异丙威(isoprocarb); 8. 仲丁威(fenobucarb); 9. 甲硫威(methiocarb)。
3.2 样品前处理条件的选择粮谷中一般含有色素、淀粉及其它物质，这些样品基质如果不除去，将严重影响氨基甲酸酯农药的测定，使回收率降低。文献中采用的谷物样品前处理方法步骤繁多，本实验在借鉴谷物和其它基体如水果、蔬菜等前处理方法的基础上，对粮谷样品前处理方法进行了研究和优化。
3.2.1 提取溶剂的选择 提取溶剂的选择主要取决于被测物质的性质，并考虑被测样品的性质。氨基甲酸酯类农药的提取溶剂文献报道有甲醇、丙酮[１０]、乙腈[1１]、丙酮二氯甲烷、乙酸乙酯[1２]、乙醇乙酸乙酯等。本实验分别采用丙酮二氯甲烷、乙醇乙酸乙酯、丙酮、乙腈作为提取溶剂，结果发现，丙酮二氯甲烷提取时易发生乳化现象，不易控制；乙醇乙酸乙酯提取时，灭多威回收率不理想（小于60％），不能满足同时提取9种农药；用丙酮和乙腈提取时，回收率都较好，相差不大，但丙酮提取步骤稍多(称取200 g磨碎的小麦粉置于80 mL小烧杯中，加6 mL水润湿样品，20 min后加入20 mL丙酮，均质1 min后过滤，滤液经35℃减压浓缩至约6 mL，残液转移至150 mL分液漏斗中。加入10％NaCl 15 mL，用10 mL二氯甲烷分两次提取。合并二氯甲烷层，用无水硫酸钠脱水后减压浓缩)，而乙腈提取过程相对简单。故选用乙腈作提取溶剂。实验发现，谷物样品在采用有机溶剂提取前加少量水润湿，可提高提取效率。
3.2.2 中性氧化铝层析柱净化 利用有机溶剂提取样品中的农药时，同时会将样品中的其它成分提取出来。这些内源性杂质进入质谱检测器，将严重影响被测物的离子化过程，产生离子抑制效应，导致灵敏度降低，所以必须除去这些干扰物。实验中采用5％水脱活过的中性氧化铝层析柱净化，净化效果比较理想，可除去其中的大部分杂质，而不影响被测物的流出。选丙酮乙醚混合溶剂作为洗脱剂可以将9种农药洗脱下来，其中回收率随丙酮比例增加而提高，但同时洗脱下来的杂质也增多。为保证洗脱完全，且避免杂质干扰过大，实验考察了不同淋洗强度（丙酮含量分别为10％、15％、20％、25％和30％）不同淋洗体积（50、60、80、100及120 mL）的影响，采用80 mL丙酮乙醚（20∶80）洗脱可获得较满意的结果。
3.3 线性关系、回收率、精密度和检出限为了消除因基质而带来的离子抑制对定量测定的影响，需用空白样品提取液来配制所使用的一系列基质标准工作溶液，绘制标准曲线进行定量。在确定的最佳液质分离条件下，进行测定。以各组分的峰面积（Y）对浓度(X，mg/L)绘制标准曲线，线性关系和相关系数见表3。结果表明，
图2 小麦样品中添加0.001 mg/kg氨基甲酸酯类农药的色谱图 略
1～9同图1 (the peaks from 1 to 9 are the same as as in Fig.1)。9种氨基甲酸酯类农药在低浓度范围0.1～100 μg/L线性良好，可以满足定量分析的需要。
在空白小麦样品中添加不同含量的4个水平9种 氨基甲酸酯农药的混合标准溶液，按照2.2步骤进行回收率实验。每个添加浓度平行重复8次操作，测定精密度，结果见表3。由表3可以看出，9种氨基甲酸酯类农药在0.001～0.05 mg/kg浓度范围之间，加标回收率在73.40％～102.0％，其8次测定的RSD在1.25％～9.94％之间。方法的准确度和精密度均符合残留分析的要求。添加水平为0.001 mg/kg的小麦样品色谱图见图2。对小麦样品中9种氨基甲酸酯类农药残留量检测方法的检出限均为1 μg/kg，是目前氨基甲酸酯类农药检测灵敏度最高的方法。
表3 线性关系、相关系数和标准加入回收率 略
3.４ 实际样品的测定从市场上购买了小麦，按所建立的方法进行处理和实样测定。由于净化时所用的氧化铝柱材料中的杂质对仲丁威存在干扰，但其检出浓度低于1 μg/kg，故认为未检出。
参考文献
1 The Compilation of Residue Limits Standards for Pseticides and Veterinary Drugs in Foodstuffs in Major Trading Countries and Reigons(主要贸易国家和地区食品中农兽药残留限量标准). Beijing(北京)：China Standards Press (中国标准出版社)，2004
2 Kawasaki M， Inoue T, Fukuhara K， Uchiyama S. Journal of the Food Hygienic Society of Japan， 1999， 40（5）： 382～390
3 de Llasera Ｍ Ｐ Ｃ， González Ｍ Ｂ. Water Research， 2001， 35（8）： 1933～1940
4 Fernandez Ｍ， Pico Ｙ， Manes Ｊ. J． Chromatogr． A， 2000， 871（12）： 43～56
5 Yang Dajin（杨大进）, ZhangYing（张 莹）, Fang Congrong（方从容）. Journal of Hygiene Rsearch（卫生研究）, 1994, 23（2）： 97～100
6 Jia Ｗei（贾 薇）, Wang Leishi（王磊石）, Zhao Lei（赵 雷）, Yu Xiaoying（于晓英）, GouYanling（勾艳玲）. Chinese Journal of Health Laboratory Technology（中国卫生检验杂志）, 2003, 13（2）： 205～206
7 Yu Wenlian（于文莲）, Wang Chao（王 超）, Chu Xiaogang（储小刚）. Chinese Journal of Chromatography（色谱）, 1998, 16（5）： 430～432
8 Goto Ｔ, Ito Ｙ, Yamada Ｓ, Matsumoto Ｈ, Oka Ｈ, Nagase Ｈ. Anal． Chim． Acta, 2006, 555(2)： 225～232
9 Goto Ｔ, Ito Ｙ, Oka Ｈ, Matsumoto Ｈ, Oka Ｈ, Ohkubo Ｃ, Nakazawa Ｈ, Nagase Ｈ. Anal． Chim． Acta, 2005, 531(1)： 79～86
10 Fernandez Ｍ, Pico Ｙ, Manes Ｊ. J. Chromatogr．, 2003, 58(34)： 151～158
11 Liu Changwu（刘长武）, Liu Xiaowei（刘潇威）, Zhai Guangshu（翟广书）. Chinese Journal of Chromatography（色谱）, 2003, 21（3）：255～257
12 Jansson Ｃ, Pihlstrm Ｔ, sterdahl Ｂ Ｇ, Markides Ｋ Ｅ. J． Chromatogr． A, 2004, 1023： 93～104
1(浙江省出入境检验检疫局，杭州 310012)
2(浙江大学化学系，杭州 310028)
3(浙江科技学院，杭州 310012)
４（绍兴出入境检验检疫局，绍兴 312000）