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摘 要 为考察柱色谱分离和索氏提取两种固体样品提取方法对提取物组成的影响，探索操作条件温和、溶剂使用量经济的固体样品提取方法。本研究以吡啶为溶剂，对准葛尔黑岱沟、平朔、潞安常村3种不同变质程度的煤样进行了柱色谱分离和索氏抽提。提取物用凝胶色谱、电喷雾质谱和同步荧光光谱进行分析，比较和确定不同提取方法对煤提取物中组分分子量分布和结构的影响。分析发现，柱色谱分离与索氏提取相比，抽提率略有增加，但柱色谱提取物组分中缺失了提取样品中结构稳定的超大分子结构片断；质谱结果显示柱色谱抽提物中主要存在5个组分，提取物组分相对于索氏提取物单一、富集度高；同步荧光显示柱色谱提取物中芳香化合物的基本组成为3~5个环的芳香化合物。实验结果表明：如仅分析质量数小于1000 amu的化合物，柱色谱法可替代索氏提取法。
关键词 煤吡啶提取物，柱色谱，索氏抽提，凝胶渗透色谱，电喷雾质谱，同步荧光
Ｉnfluence of Ｃolumn Ｃhromatography and Soxhlet Ｅxtraction on the Ｃomposition of Ｃoal Ｐyridine Ｓoluble
Li Wenying, Ye Cuiping, Feng Jie, Xie Kechang
(Key Laboratory of Coal Science and Technology, Ministry of Education and Shanxi Province,Taiyuan University of Technology, Taiyuan 030024)
Abstract This study discussed the composition of coal pyridine soluble from columnchromatography (CC) and the Soxhlet extraction method. A, B and C coal samples were extracted by pyridine using CC and Soxhlet extraction methods at 25℃ and 120℃, respectively. Gel permeation chromatography (GPC) coupled with photo diode array (PDA) detector was applied to determine molecular weight (MW) distribution and structure characteristics within the range of 210－400 nm. Electrospray ionization mass spectrometer (ESIMS) and synchronous fluorescence spectroscopy with constant wavenumber were employed to investigate the detailed structure features and polyaromatic property. Results showed that the pyridine extraction ratio of CC was higher than that of Soxhlet method although some compounds with ultra high MW were filtered by silica gel used in CC. The extracts from CC could present better S/N (signal to noise) diagram in MS spectra, five individual compounds had been identified that mainly consist of 3－5 aromatic rings. Nevertheless, there are lots of impurity information from Soxhlet extracts in MS spectra and difficult to make further structure analysis. In conclusion, CC would be a better substitute of Soxhlet extraction if we just concern the compounds with less than 1000 amu MW.
Keywords Ｃoal pyridine soluble, column chromatography, Soxhlet extraction, gel permeation chromatography, electrospray ionization mass spectrometry，synchronous fluorescence spectroscopy
1 引 言
索氏抽提是常用的固体消解和抽提方法，但缺点是抽提时间长（≥24 h），而且对于高沸点溶剂操作温度高（吡啶12０℃，N甲基吡咯烷酮207℃），长时间在较高温度下的操作可能造成样品性质的改变。柱色谱分离也称萃取柱色谱法，是一种将萃取过程与色谱分离相结合的方法。该方法已广泛用于石油族组分的分类、煤衍生液体的分离等复杂样品分析的前处理 [1～4]。与索氏抽提相比，由于部分大分子化合物与吸附剂发生不可逆吸附，柱色谱分离时回收率不能达到100%。但样品分离量大，吸附剂、溶剂的用量少，分离时间短，得到的是窄馏分，特别是由于降低了溶剂（吡啶）的干扰，在分析之前无需再处理，从而简化了分离步骤，使分析时间缩短，提高了分离效率。
煤中可溶解于吡啶的组分主要为芳香度较高，具有不同长度烷基和含O、N、S杂原子基团取代的多官能团极性化合物[1]，占煤总重的10％~40%左右。这部分化合物的数量直接影响煤液化过程的耗氢量、产物的收率、稳定性以及催化剂的活性，对这部分化合物的结构和性质的了解有助于选择合适的供氢溶剂和催化剂对煤进行降解。在以往的研究中对煤中极性化合物的分析主要以液相色谱为主[5～7]，但对这部分化合物的了解，迄今还处在一个化合物总量和芳香环系分布等性质的研究阶段[6, 8]。一方面是由于上述化合物的分子量分布范围宽，不论是正相还是反相色谱都难以满足同时分离所有组分的条件；另一方面是由于吡啶溶剂本身具有较高的极性，脱除溶剂的过程比样品分析本身还要困难。
本研究选取黑岱沟（A）、平朔（B）、常村（C）3种不同变质程度的中国典型动力用煤，以吡啶为溶剂，用柱色谱分离和索氏抽提两种方式进行抽提，提取物用凝胶渗透色谱（GPC）、电喷雾质谱（ESIMS）和荧光光谱进行分析。通过比较两种提取物中极性化合物分子量分布、平均分子量及结构方面的信息，考察是否可以用柱色谱分离这一固体抽提方式代替索氏抽提来实现对煤样品的抽提、分离和分析。
2 实验部分
2.1 样品制备
实验选取准格尔黑岱沟长焰煤（A）、平朔气煤（B）和潞安常村贫煤（C）3种变质程度不同的我国典型动力煤种，干燥粉碎后过筛，取0.074~0.090 mm筛分，50℃下干燥过夜。
2.1.1 柱色谱分离
分别称取5 g和（10±0.2） g硅胶在200℃下活化1.5 h，待冷却到室温后取出装柱( 30 mm×180 mm，柱下端有一约2 mm厚的玻璃烧结板),用N甲基吡咯烷酮（NMP）和丙酮各30 mＬ淋洗，以除去硅胶中的杂质，抽真空干燥待用；梨形烧瓶中加入（1±0.2） g煤样和50 mＬ乙腈超声15 min后，加入洗净、干燥的硅胶10 g再超声20 min。将煤样、硅胶和乙腈的混合物减压蒸馏，待完全干燥后，倒入装有洗净、干燥的5 g硅胶的抽提柱中。常温柱色谱连续抽提，抽提溶剂依次为乙腈、四氢呋喃（THF）、吡啶、NMP。在操作过程中，硅胶表面保持水平。然后加入乙腈100 mL淋洗，提取液完全流出柱子后，用4×25 mL的乙腈在抽真空下洗脱滞留在体系中的乙腈可溶物，收集淋洗液。柱色谱在抽真空下干燥1~2 h，待质量恒定后进行下一步操作及抽提率的计算。由于NMP粘度较大，提取后用去离子水淋洗柱色谱后干燥，各溶剂的抽提率分别计算。
2.1.2 索氏抽提
称取(2.0±0.2) g煤样装入滤纸套中，然后放入250 mL索氏抽提器中，加入100 mL吡啶，用恒温油浴加热(120℃) ，抽提至回流液变为无色时停止实验。残煤用丙酮淋洗以除去部分残留在煤中的吡啶及提取物，干燥后计算抽提率。２种提取物通过减压蒸馏，去溶剂后，110℃下真空干燥后备用。３种煤的吡啶抽提率见表1，抽提率计算方法见文献［9］。分别称取1.5 mg吡啶提取物用NMP/THF（3∶7, V/V）溶解，用0.45 μm微孔滤膜过滤，定容到15 mL用于凝胶色谱分析。表1 柱色谱和索氏抽提的抽提率（略）
2.2 仪器及操作条件
(1)凝胶色谱 体系由Waters 600E溶剂输送泵，两根Waters Ultrastyragel 50 nm和styragel HT4 (78 mm×300 mm, 10 μm), 固定相为聚苯乙烯二乙烯基苯凝胶柱(分子量范围100~600,000 amu)串联组成。凝胶色谱校正标样为单分散聚苯乙烯，以NMP/THF(3∶7, V/V) 混合溶剂作流动相，流速1 mL/min，体系在40℃下操作，进样量20 μL。以Waters 996 二极管阵列（PDA）为检测器，检测波长为210~400 nm，分辨率为1.2 nm。本实验所用凝胶体系的排阻极限V0约在11.3 mL，Vt约在22.5 mL，校正曲线略。(2)质谱分析 采用Waters ZMD 4000，电喷雾电离（ESI）质谱仪（美国Waters公司），样品用甲醇稀释后注射泵直接进样，速率为5 μL/min，正离子方式扫描，扫描范围300~3930 amu。离子源的毛细管电压3.5 kV, 锥孔电压30 V, 提取锥孔电压5 V，温度100℃, 去溶剂气温度200℃。(3)同步荧光分析 采用Varian公司的Cary Eclipse (EL05033883)荧光分光光度计，激发光和发射光狭缝宽度均为5 nm。发射光和激发光的波长差Δλ=14 nm，扫描范围为250～650 nm，扫描速率为600 nm/min；石英样品池光程1 cm。激发过滤设为自动，发射过滤设为打开。以溶剂THF/NMP（7∶3，V/V）稀释样品（浓度控制在5 mg/L）后分析。
3 结果与讨论
3.1 两种方法对样品抽提率的比较
由表1的数据可知，柱色谱分离的吡啶抽提率分别为样品A 22%，B 22.4%，C 10.2%，均高于索氏抽提方法。尽管柱色谱分离中使用的样品经过乙腈和四氢呋喃的处理，但其吡啶的提取率仍较未处理样品的索氏提取率高。这是由于柱色谱分离的实验步骤决定抽提的过程由若干个连续的步骤组成，以获得不同溶剂的抽提率；不同极性的溶剂可以打破煤结构中不同的相互作用力，如氢键、ππ*相互作用等[10]，提高了提取率。柱色谱分离在使用吡啶之前，依次用乙腈、四氢呋喃进行了抽提，脂肪类和芳香族化合物已被抽提出来[11, 12]，因而吡啶更容易进入煤分子结构内部与煤分子形成氢键，削弱煤分子间的作用力，得到较多的提取物。
3.2 提取物的分子量分布比较
两种方法提取物的分子量分布由凝胶色谱测定。由样品的二极管阵列（PDA）谱图中提取任一波长吸收强度随时间的流出曲线计算3个样品的分子量分布。图1（A～C柱色谱，A′～C′索氏抽提）选取了吸收强度最大的285 nm下的流出曲线作为分子量分布计算曲线，其它波长下的流出曲线规律类同。由图1可以看出，两种方法所得到的提取物都由流出时间在8~13 min（组分1，大分子组分）和16~23 min（组分2，小分子组分）的两组峰构成，与校正曲线比较可知，组分1的分子量在120000~387000 amu之间，但其中有相当一部分（>90%）超过了排阻极限;组分2的分子量分布位于标定曲线线性范围内从110~7300 amu。表2列出了由峰面积归一化得到样品各组分的相对含量。对于小分子组分，两种方法除相对含量略有不同外，分子量分布基本一致；对于索氏提取样品（Soxhlet extracts）。大分子组分，3个样品的索氏提取物的分子量分布均大于柱色谱分离产物，特别是索氏提取物中含有部分靠近排阻极限的组分（分子量约在400,000 amu以上），而这部分化合物会吸附在柱色谱所用硅胶表面（孔径8~10 nm）无法洗脱。分子量分布的结果表明：两种固体化合物的提取方法，所得到的样品种类并无本质差别，区别仅在于柱色谱所用硅胶会吸附吡啶可溶物中的超大分子组分，使其无法脱附。表2 吡啶提取物中各组分的相对含量（略）注(note)：A,B,C. 柱分离样品(column chromatography); A′, B′, C′. 索氏提取样品(soxhlet extracts)。
3.3 提取物的质谱结果比较
鉴于研究目的和提取物中化合物的数量庞大（2000~4500个化合物），本研究仅在宏观上对两种提取方法提取物的谱图进行比较，以确定化合物主要组分的区别。
由图２可见，样品A、B、C中柱色谱提取物中出现的组分基本都包含在索氏提取物中。样品A、C在质量数高端组分的信号强度使中低质量数范围内的信号淹没于背景噪音中，柱色谱丢失的组分主要是质量数高端的化合物。考虑到样品B在两种提取方法中都表现出最高的提取率，其结构容易在提取溶剂的作用下发生解聚，在相同的提取溶剂环境中，其中低分子量范围内化合物的组成和结构基本相同，两种提取物的质谱结果是最接近的。高分子量范围内，样品A、C索氏提取率不及样品B的一半，样品芳构化程度较高，吡啶难以解缔其化学结构，仅能缔合其结构边缘的侧链和连接不同大分子片断间的桥健。在桥健断裂后，高质量数的大分子片段会存在于吡啶溶剂中。由于硅胶的吸附作用，质量数高端的化合物不出现在柱色谱提取物质谱中，虽然这在一定程度上损失了大分子片断的结构信息，但在另一方面，正是由于硅胶对分离溶剂的吸附，质谱的信噪比大大增强，索氏提取物中被噪音掩盖的主要组分在柱色谱提取物中能够清晰地辨认，而且，对于相对完整的超大分子化合物，无法从单独的质谱中得到其详细的结构信息，需要其他分析方法辅助。
对样品A柱色谱分离物的质谱图进一步分析可以发现，在低分子量段，大约有[M1=2７８.3 amu], [M2=390.4 amu]和[M3=578.5 amu]3个组分, 由于电喷雾质谱的离子化特性，3个化合物分别表现为［M1+Na］+和［M1+K］+ （M1质量数在扫描范围外，但可以很合理的通过其加合物判断）[M2+H]、[M2+Na]+、[M2+K]+以及化合物3与抽提溶剂吡啶（C5H5N）和流动相甲醇（MeOH）的溶剂加合离子[M3+H]+、[M3+(C5H5N+MeOH+H)]+、[M3+2(C5H5N+MeOH+H)]2+。同样，样品B和样品C中也发现[M1=２７８.3 amu], [M2=390.4 amu]的化合物，并且在后两个样品中还存在[M4=343 amu]和[M5=363 amu]的化合物，表现为相差2个质量数的化合物系列，即［M4±H2］和［M 4－2H2］以及[M5+H2]，由相差一到两个环或双键的化合物构成。
3.4 提取物的荧光光谱
采用同步荧光光谱法对两种提取方法及提取物进行比较，以确定抽提物中多环芳烃的结构特征结果如图3（a、b、c）。通过对比两种提取方法得到的提取物的荧光光谱可知，索氏提取样品(Soxhlet extracts)。样品A两种方法提取物的荧光光谱非常相似，最强峰的波长为407 nm，在363和446 nm处也出现分离良好的谱峰，表明样品A两种提取物以3~5环的芳香环系结构为主要组分。
样品B和C索氏提取物的荧光光谱与柱色谱提取物相比，发生明显蓝移（对应的最大波长分别为：B 448 nm，B′400 nm；C 450 nm，C′362 nm），原因可能是：这两个样品的索氏提取物中脂肪烃含量较高，这部分组分不仅不产生荧光，还会使总的荧光谱峰发生不同程度的蓝移。饱和烃的含量越高，蓝移越明显[1３]。在柱色谱提取物中，样品B(图3b)在448、408和422 nm处有明显的荧光峰。体系中应以4~5环的芳香结构为主，363 nm处的肩峰说明样品中同时存在部分3环的芳香结构。样品C（图3c）在波长450 nm左右荧光强度最大，在332 nm处有一明显的谱峰，表明样品C以2环和5环的芳香结构为主构成。400、424和485 nm处出现的肩峰，表明样品中存在4环和5环以上的结构。考虑到芳烃的荧光效率随其环数的增加而显著增加；485 nm处的肩峰的荧光强度较小，表明样品中5环以上的结构较少。因此，柱色谱提取物主要由3~5环的芳香环系结构组成。2环以下和5环以上的结构较少，在提取物中没有发现单环化合物。索氏提取物由于荧光谱带蓝移严重，无法通过对谱带位置归属判断样品中的芳环结构。
煤的吡啶提取物应以多环芳烃等较稳定的结构组成，是煤骨架结构的反映，从柱色谱的分离物可以看出，3～5个环的稳定芳香结构是煤大分子骨架的主体，利用柱色谱的分离方法，可以较方便的区分不同样品的大分子骨架大小，预测样品结构的稳定性。
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(太原理工大学，煤科学与技术教育部和山西省重点实验室 ，太原 030024)
本文系长江学者和创新团队发展计划、国家自然科学基金(No.20476068, No.90410018)、山西省自然科学青年基金(No.20041008)、教育部科学技术研究重点项目(No.204021)、973项目(No.2004CB2176002)共同资助