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摘要：目的建立清肝片的质量标准。方法采用薄层色谱法鉴别板蓝根、茵陈和甘草;采用高效液相色谱法测定样品中甘草酸的含量,高效液相的色谱条件为：Agilent Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为甲醇-0.2 mol?L-1醋酸铵溶液-冰醋酸（67∶33∶1）。结果薄层鉴别专属性强，高效液相色谱法甘草酸铵在0.36～1.80 μg范围内呈良好的线性关系，平均回收率98.33%，RSD为1.24%。结论该方法可更好地控制清肝片的质量。
关键词： 清肝片； 甘草酸； 薄层色谱； 高效液相色谱
Quality Standard of Qinggan Tablet
RUAN Qun, TAN Chunyan, CHEN Rong
(Guangxi Yulin Pharmaceutical Co.,Ltd,Yulin, Guangxi ,537001)
Abstract：ObjectiveTo establish the quality standard of Qinggan Tablet.MethodsTLC was used to identify Radix Isatidis, Herba Artemisiae Scopariae and Radix Glycyrrhizae; and HPLC was used to determine the content of Glycyrrhiziate acid. Agilent Eclipse XDB-C18 column（4.6 mm×250 mm，5 μm）with mobile phase of methanol-0.2 mol?L-1 ammonium acetate solution-glacial acetic acid(67∶33∶1) was used for the determination of puerarin. ResultsThe TLC for identification was special and the linear range of puerarin was 0.36～1.80 μg and recovery rate was 98.33%, RSD was 1.24%,respectively. ConclusionThis method can be used to control the quality of Qinggan Tablet better.
Key words：Qinggan Tablet； Glycyrrhiziate acid； TLC； HPLC
清肝片是由板蓝根、茵陈、甘草3味中药组成，具有清热解毒、疏肝退黄的功效，用于急、慢性肝炎［1］。为了有效控制该产品的质量，对方中板蓝根、茵陈、甘草进行了定性鉴别，采用HPLC法测定甘草中主要活性成分甘草酸的含量，结果方法简便，准确，重现性好，可适用于该制剂的质量控制。
1 仪器与试药
1.1 仪器Agilent1100系列高效液相色谱仪, Agilent1100化学工作站；CQX25-06超声波清洗器(上海必能信超声有限公司)。
1.2 试药清肝片(广西玉林制药有限责任公司生产);甘草酸铵对照品（供含测用,批号:110731-200510），靛玉红与靛蓝对照品，板蓝根、茵陈、甘草对照药材均由中国药品生物制品检定所提供;甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
2 定性鉴别
2.1 茵陈取本品6片，除去糖衣，研细，加甲醇10 ml浸渍30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 ml溶解，作为供试品溶液。另取茵陈对照药材1 g，按供试品溶液提取方法制备成每毫升含0.5 g的对照药材溶液。再按标准处方比例和制备方法制备缺茵陈的阴性样品，然后按供试品溶液提取方法制备成阴性对照液。照薄层色谱法（《中国药典》2005年版Ⅰ部附录VIB）实验，吸取上述溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（60~90℃）-醋酸乙酯-丙酮（5∶3∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以浓氨水，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材相应的位置上显相同蓝色的荧光斑点（阴性对照无干扰）。见图1。
2.2 甘草取本品15片，除去糖衣，研细，称取2 g，加乙醇25 ml，超声提取30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml溶解作为供试品溶液。另取甘草对照药材1 g，按供试品溶液提取方法制备成每毫升含0.5 g的对照药材溶液，再按标准处方比例和制备方法制备缺甘草的阴性样品，然后按供试品溶液提取方法制备成阴性对照液。照薄层色谱法（《中国药典》2005年版Ⅰ部附录VIB）实验，吸取上述3种溶液各5 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯-丙酮-无水乙醇-氨试液（5∶1∶2∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇液，在105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材相应的位置上显相同橙黄色的斑点（阴性对照无干扰）。见图2。
2.3 板蓝根取本品10片，除去糖衣，研细，用三氯甲烷20 ml超声处理30 min，提取液置蒸发皿中蒸干，残渣加三氯甲烷2 ml溶解，作为供试品溶液。另取板蓝根对照药材1 g，按供试品溶液提取方法制备成每毫升含0.5 g的对照药材溶液，再分别取靛玉红与靛蓝对照品适量，加乙醚制成每毫升含靛玉红0.5 mg、靛蓝0.6 mg的溶液，作为对照品溶液。再按标准处方比例和制备方法制备缺板蓝根的阴性样品，然后按供试品溶液提取方法制备成阴性对照液。照薄层色谱法（《中国药典》2005年版Ⅰ部附录VIB）实验，吸取上述溶液各10 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，石油醚(60~90℃)-醋酸乙酯-丙酮 (7∶0.5∶2.5)［2，3］为展开剂，展开，取出，晾干，供试品色谱中，在与对照药材、对照品相应的位置上，分别显相同颜色的斑点（阴性对照无干扰），见图3。
3 甘草酸的含量测定
3.1 色谱条件Agilent Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相：甲醇-0.2mol?L-1醋酸铵溶液-冰醋酸（67∶33∶1），流速：1.0 ml?min-1；检测波长：250 nm；柱温：28℃；进样量：10 μl。理论塔板数按甘草酸铵计算应不低于3 000。
3.2 对照品溶液的制备精密称取甘草酸铵对照品18 mg，置100 ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，制成每毫升含0.180 mg的对照品贮备液(相当于每毫升含甘草酸0.176 3 mg)。精密吸取该贮备液3.0 ml，置5 ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，制成每1ml含0.108 mg的对照品溶液。
3.3 供试品溶液的制备取本品24片，除去糖衣，研细，称取约1.2 g，精密称定,置具塞锥形瓶中，精密加入流动相30 ml，密塞,称定重量,浸泡1 h，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用流动相补足减失的重量,摇匀，滤过，弃去初滤液，续滤液经0.45 μm滤膜滤过，作为供试品溶液。
图1 茵陈TLC（略）
图2 甘草TLC（略）
图3 板蓝根TLC（略）
3.4 空白实验按处方及制备工艺制备不含甘草药材的阴性样品，再按供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。按照上述色谱条件，吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μl，分别注入液相色谱仪，进行测定。结果供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，有相同保留时间的色谱峰，而阴性对照在此保留时间无干扰（见图4~6）。因此可在此系统条件下对甘草酸进行定量分析。
图4 对照品色谱图（略）
图5 供试品色谱图（略）
图6 阴性对照色谱图（略）
3.5 线性关系考察精密吸取3.2项的对照品贮备液2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 ml，分别置于10 ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取10 μl，注入液相色谱仪,记录峰面积,以对照品进样量(μg)为横坐标,峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为Y=1.302 8×103X - 5.866 8;r=0.999 9，甘草酸铵在0.36～1.80 μg范围内呈良好的线性关系。
3.6 精密度实验精密吸取同一供试品溶液，按上述色谱条件进行分析，重复进样6次,结果峰面积均值为850.94， RSD=0.98％。
3.7 重复性实验平行制备清肝片(批号为541003)的供试品溶液6份,照3.1项下的色谱条件进行测定，结果平均含量0.453 8 mg/片, RSD=1.25％。
3.8 稳定性考察精密吸取供试品溶液10 μl，分别在0，2，4，6，8，10，12 h进样一次，测定峰面积， RSD=1.05%。表明供试品溶液在12 h 内稳定。
3.9 加样回收率实验称取已知含量为0.445 1 mg/片的清肝片除包衣药粉0.6 g,精密称定,分别精密加入浓度为0.180 mg?ml-1的对照品贮备液3.5，3.5，5.0，5.0，6.5，6.5 ml，照3.3项下制备供试液，依法测定，计算回收率。结果见表1。
表1 甘草酸加样回收率计算结果（略）
3.10 样品测定按3.2和3.3项方法分别制备对照品溶液和供试品溶液，按上述色谱条件，精密吸取10 μl，注入色谱仪，测定。结果见表2。
表2 样品测定结果（略）
4 讨论
4.1 本标准对制剂中的板蓝根、茵陈、甘草进行了薄层鉴别，结果与对照品或对照药材斑点一致，效果较好。其中在板蓝根薄层鉴别中选用甲醇为溶媒,靛蓝斑点不明显,而选用三氯甲烷为溶媒时, 靛玉红靛蓝斑点清晰；鉴别茵陈时,选用5%的氢氧化钾为显色剂,阴性有轻微干扰,经多次试验发现是甘草干扰，当选浓氨水作为显色剂时,阴性干扰消失；在甘草薄层鉴别中,曾参考文献［4，5］中的展开剂，但效果都不理想，经摸索用醋酸乙酯-丙酮-无水乙醇-氨试液（5∶1∶2∶1）比较好，氨试液要求临用新配。
4.2 在提取过程中，曾用甲醇、流动相、稀乙醇三种不同的溶剂提取清肝片，结果用流动相作为提取溶剂时，得到的色谱峰峰形较好，能达到基线分离。同时比较了浸泡与不浸泡的提取，结果先浸泡一个小时再超声处理，提取得到的甘草酸含量更高。
4.3 采用甘草酸铵作为对照品，因为在流动相含有醋酸的条件下，甘草酸铵和甘草酸的保留时间是一致的，在计算含量时，需将甘草酸铵的量折算成甘草酸的量，因此不影响测定结果。
参考文献：
［1］ 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］．北京：化学工业出版社，2005：59.
［2］ 宗玉英,党合群,杨风梅.薄层扫描法的测定复方板蓝根胶囊中靛玉红含量［J］.青海医药杂志,2000,30(3):52.
［3］ 张玉蛾,李献州.薄层-紫外法测定咽炎合剂中齐墩果酸、靛蓝、靛玉红的含量［J］.中成药,1999,21(4):205.
［4］ 陈 平，戴 忠，高咏莉，等.糖尿灵片的质量标准研究［J］.中成药，2005，27（8）：903.
［5］ 孙守景，高剑峰，李兰忠，等.加味酸枣仁合剂质量控制方法的研究［J］.中国中医药信息杂志，2005，12（6）：44.
(广西玉林制药有限责任公司，广西 玉林 537001)