荭草素和异荭草素对照品的制备

　　【摘要】  目的： 建立荭草素和异荭草素对照品的制备方法。方法: 用萃取、硅胶柱层析、重结晶等方法对荭草水提取物进行分离纯化，通过MS、IR、1HNMR、13CNMR对其分离产物进行结构鉴定。结果: 薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）检测分析，荭草素和异荭草素的纯度分别为98.03%和98.26%。结论: 本方法简便,产品纯度高,该对照品可作为控制荭草及其制剂质量的指标成分。

　　【关键词】  红蓼； 色谱法，薄层； 色谱法，高压液相； 荭草素； 异荭草素； 对照品

　　Preparation of Reference Substances of Orientin and Isoorientin

　　ZHAO Ping, LI Yongjun, HE Xun, WANG Aimin, WANG Yonglin

　　(School of pharmacology, Guiyang Medical college, Guiyang 550004, Guizhou, China)

　　［Abstract］ Objective: To establish a method for preparing the reference substances of orientin and isorientin. Methods: Orientin and isoorientin were isolated and purified from the water-extract of Polygonum orientale by solvent extraction, silica gel column chromatography, and recrystallization. Their structures were determined by spectroscopic methods (MS, 1H- and 13C-NMR).The purity of the products was meaeured with thin-layer chromatography(TLC)and high pressure liguid chromatography(HPLC) Results: TLC and HPLC analysis showed that the purity of orientin and isoorientin was 98.03% and 98.26% respectively. Conclusion: The method developed is simple and effective for producing products with high-purity.The products obtained can be used as index in the quality control of Polygonum orientale and its pharmaceutical preparation.

　　［Key words］ Polygonum orientale; chromatography,thin layer; chromatography,high pressure liquid; orientin; isoorientin; reference substance

　　荭草为蓼科植物荭蓼(Polygonum orientale L.)的干燥果穂及带叶茎枝，具有清热解毒、祛风除湿、活血消肿的功效，用于治疗风湿性关节炎、冠心病、疝气、疮肿等［1］。前期的研究已从荭草中分离得到黄酮、木脂素、甾体皂苷等多类成分［2~4］。最近对该植物的化学成分和质量研究也证实，以荭草素和异荭草素为主的黄酮苷是其水溶性部位的主要成分［5，6］。在随后的药理筛选实验中，发现荭草水溶性部位有较好的抗心肌缺血和抗缺氧。这些研究结果表明，以荭草素和异荭草素为主的黄酮苷可能是其主要活性成分。付晓春等［7］也在最近的研究中证实荭草素对缺血、缺氧心肌具有明显的保护作用。为控制荭草药材及其制剂质量，在荭草提取工艺研究的基础上，对荭草素和异荭草素的对照品制备方法进行了研究，建立了以萃取、硅胶柱层析、重结晶为手段的能大量制备荭草素和异荭草素的对照品的方法，该法分离所得荭草素和异荭草素的纯度分别为98.03%和98.26%［8］。

　　1  仪器与试药

　　Varian INOVA-400核磁共振波谱仪；HPLC-MSD电喷雾质谱仪；岛津高效液相色谱系统，包括LC-10ATvp泵、SPD-10Avp检测器；Rheodyne 7725i手动进样阀（美国Rheodyne公司）；WML色谱工作站（广西威玛龙色谱科技公司）。色谱用硅胶（200～300目）及硅胶G预制板由青岛海洋化工厂生产，色谱用聚酰胺由浙江黄岩化工厂生产。乙腈(色谱纯)、甲醇（色谱纯）、磷酸（分析纯），水为重蒸水，其它试剂均为分析纯。实验样品采自贵州省贵阳市鹿冲关，由贵阳医学院药学院生药学教研室龙庆德副教授鉴定为Polygonum orientale L。

　　2  方法与结果

　　2.1  药材的提取与分离

　　取荭草药材15 kg，用10倍量水煎煮3次，每次1 h，滤过，滤液浓缩至15 kg， 加乙醇30 kg，搅拌均匀，静置12 h，抽滤，滤液减压回收乙醇并浓缩至15 kg，用1/2倍量水饱和的正丁醇提取4次，合并正丁醇液，用1/8倍量水洗2次，减压回收正丁醇，得到富集黄酮类化合物浸膏120 g。

　　2.2  化合物的分离

　　120 g浸膏用50%乙醇500 ml溶解，加200 g硅胶(200~300目)搅拌，自然晾干，研细，过80目筛，备用；取硅胶(200~300目) 2 400 g，用水饱和醋酸乙酯湿法装柱；将拌样硅胶上于装好的硅胶柱表面，用水饱和醋酸乙酯∶冰乙酸 (10 000∶1) 洗脱，分段收集，各段在硅胶G预制板上点样，用醋酸乙酯-甲酸-水(10∶0.5∶0.5)展开，喷以10%硫酸乙醇试液，加热显色，检查Rf =0.5（荭草素）和Rf =0.3（异荭草素）的2个黄色主斑点部分，分别回收溶剂。荭草素部分的残留物用100 ml甲醇超声溶解过滤，滤出的沉淀物用适量50%乙醇加热回流溶解放置，结晶完全后，滤出结晶，再以适量甲醇加热回流溶解，加入等体积醋酸乙酯混匀，放置结晶，得荭草素的黄色粉末1.26 g；异荭草素部分的残留物用100 ml甲醇超声溶解过滤，滤出的沉淀物用适量甲醇加热回流溶解放置，结晶完全后，滤出结晶，再以适量甲醇加热回流溶解，放置重结晶，得黄色颗粒结晶2.47 g。

　　2.3  结构确定

　　2.3.1  荭草素  淡黄色粉末，盐酸镁粉反应阳性，mp 256～258 ℃。UV（MeOH）λ max：210、256.5、269、348 nm；IR(KBr)νmax：3 516，3 380（OH），2 897、1 655（C=O），1 610、1 576、1 551、1 511（Ar）cm-1；ESIMS m/z：447.1 ([M-H]-1)；1H-NMR（DMSO-d6）δ：13.18 (1H, s, 5-OH), 10.83 (1H, 7-OH), 10.05 (1H, 4′-OH), 9.07(1H, 3′-OH), 7.54 (1H, dd, J = 8.4, 2.0 Hz, 6′-H), 7.49 (1H, d, J = 2.0 Hz, 2′-H), 6.88 (1H, d, J = 8.4 Hz, 5′-H), 6.66 (1H, s, 3-H), 6.28 (1H, s, 6-H), 4.69 (1H, d, J = 10 Hz, 糖的端基氢)；13C-NMR （DMSO-d6） δ：182.0 (C-4), 164.1 (C-2), 162.5 (C-7), 160.4 (C-5), 156.0 (C-9), 149.6 (C-4′), 145.8 (C-3′), 122.0 (C-1′), 119.4 (C-6′), 115.7 (C-5′), 114.1 (C-2′), 104.5 (C-8), 104.0 (C-10), 102.4 (C-3), 98.1 (C-6), 82.0 (C-5″), 78.8 (C-3″), 73.4 (C-1″), 70.8 (C-2″), 70.7 (C-4″), 61.6 (C-6″)。以上数据与文献报道荭草素基本一致，从荭草中分离得到的此成分可确定为荭草素（orientin）［9,10］。 结构式见图1。

　　2.3.2  异荭草素  黄色颗粒结晶，盐酸镁粉反应阳性，mp 230~232 ℃。UV （MeOH）λmax：213、257、270.5、350 nm；IR(KBr)νmax：3 450~3 200（OH），1 652（C=O），1 623、1 579、1 517、1 453（Ar） cm-1；ESIMS m/z：447 ([M-H]-1)；1H-NMR（DMSO-d6）δ：13.56 (1H, s, 5-OH),10.65 (1H, brs, 7-OH), 9.95 (1H, brs, 4′-OH), 9.47(1H, brs, 3′-OH), 7.41 (1H, dd, J = 8.4, 2.0 Hz, 6′-H), 7.38 (1H, d, J = 2.0 Hz, 2′-H), 6.88 (1H, d, J = 8.4 Hz, 5′-H), 6.67 (1H, s, 3-H), 6.47 (1H, s, 8-H), 4.57 (1H, d, J = 10 Hz糖的端基氢)；13C-NMR（DMSO-d6）δ：182.0 (C-4), 163.7 (C-2), 163.3 (C-7),160.8 (C-5),156.3 (C-9), 149.8 (C-4′), 145.8 (C-3′), 121.5 (C-1′), 119.1 (C-6′), 116.1 (C-5′), 113.4 (C-2′), 108.9 (C-6), 103.5 (C-10), 102.9 (C-3), 93.6 (C-8), 81.7 (C-5″), 79.0 (C-3″), 73.1 (C-1″), 70.7 (C-2″), 70.2 (C-4″), 61.6 (C-6″) 。以上数据与文献报道异荭草素基本一致，可确定为异荭草素（isoorientin）［11,12］。结构式见图2。

　　2.4  纯度检测

　　2.4.1  杂质检查  按《中国药典》2005年版二部附录V B薄层色谱法试验。取荭草素、异荭草素分别加甲醇制成1 g/ml样品溶液，分别条带状点于聚酰胺薄膜或硅胶G薄层板上，点样量10 μl、20 μl；展开剂：聚酰胺薄膜用（1）甲醇-水-冰醋酸（4∶1∶1）；（2）甲醇；（3）醋酸。硅胶G薄层板用：（1）醋酸乙酯-甲酸-水(10∶0.5∶0.5)；（2）氯仿-甲醇-甲酸(8∶2∶0.5)。显色剂：聚酰胺薄膜2%的AlCl3乙醇液，硅胶G薄层板2%的FeCl3乙醇液。色谱识别：聚酰胺薄膜置日光下检视或紫外光灯（365 nm）下检视，硅胶G薄层板置日光下检视。结果：在2种薄层板上经5个展开系统多种显色方式检识均呈单一斑点，色谱中不显杂质斑点，结果见图3、图4。

　　2.4.2  峰面积归一化法纯度检查  Hypersil C18(5μm，200 mm×5.0 mm)色谱柱；甲醇-0.1%磷酸溶液（26∶74）为流动相，流速：1 ml/min，温度：35 ℃，紫外检测器；荭草素、异荭草素分别加甲醇制成0.5 g/L样品溶液，进样量20 μl。在该色谱条件下，记录色谱图的时间为样品峰出峰时间的2倍，荭草素和异荭草素样品按表1所列检测波长得到色谱图，采用峰面积归一化法计算，含量均大于98%。结果见表1、图5、图6。 表1  各波长峰面积归一化的测定结果注：1.荭草素；2.杂质   注：1.异荭草素；2.杂质

　　3  讨论

　　用上述制备方法对荭草素和异荭草素进行提取、分离、纯化，其纯度和含量等均符合含量测定用对照品要求，因而可作为对照品使用。该制备方法简单可行，不需昂贵的特殊设备就可同时制得纯度98.0％以上的荭草素和异荭草素纯品，不仅成本低廉，而且适用于较大规模的制备，此法制得的对照品可作为控制荭草及其制剂质量的指标成分，具有较高的实用价值。

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