气相色谱和气相色谱—质谱法测定食品中乙草胺残留

　　【摘要】建立了气相色谱和气相色谱质谱法检测10种植物源性和动物源性食品中乙草胺残留量检测方法。粮谷类和动物源性样品采用乙腈提取，GPC结合硅胶固相萃取柱净化；蔬菜类样品采用乙酸乙酯提取、硅胶固相萃取柱净化；元葱等样品先进行微波消解，然后采用乙酸乙酯提取，硅胶固相萃取柱净化。气相色谱和气相色谱质谱联用法检测。两种方法检出限均为0.004 mg/kg; 在0.01～0.16 mg/L范围内均呈良好的线性关系，相关系数为0.9998和0.9997;在0.01、0.02和0.05 mg/kg的添加水平下，添加回收率在70%～102%之间;相对标准偏差（RSD）均小于10%。

　　【关键词】  气相色谱 气相色谱 质谱 乙草胺 食品 基质效应

　　1  引言

　　乙草胺是一种优良的选择性芽前酰胺类除草剂，可用于花生、大豆、玉米、棉花、油菜、甘蔗及豆科、十字花科、茄科、菊科和伞形花科等多种作物除草。许多国家对乙草胺有明确的限量标准[1]。特别是日本自2006年，实行“肯定列表”制度后，对各种食品中乙草胺检测要求更加严格，并分别在我国出口日本的花生中检测出乙草胺为0.08 mg/kg，在松茸中检出乙草胺残留量为0.69 mg/kg和0.04 mg/kg，都超过日本限量标准0.01 mg/kg。为促进我国的进出口贸易和打破国外的技术壁垒，建立一个准确、快速、系统的乙草胺残留量检验方法具有重要意义。目前报道[2～７]的农作物和水果中乙草胺残留量的的气相色谱质谱（GCMS）检测方法，设备成本高，检测基质单一，无法满足日本“肯定列表”的要求。本实验结合世界各国乙草胺的限量标准要求，对植物源性和动物源性食品中乙草胺残留量的检验方法进行了系统的研究。前处理采用乙腈提取粮谷和禽肉组织样品，GPC净化油脂和色素，硅胶柱净化干扰杂质，采用气相色谱法（GC）和GCMS检测和确证。同时对于乙草胺的基质效应对定量分析的影响，也进行了系统的研究，建立了一种快速、准确的食品中乙草胺残留量GC和GCMS法检测和确证方法。

　　2  实验部分

　　2.1  仪器与试剂

　　6890N型气相色谱仪，配微池电子捕获检测器（μECD）、68905973i型气相色谱质谱仪（美国Agilent公司）; AcuuPrep型凝胶渗透色谱仪（美国J2 Scientific公司）; 硅胶柱（1 g，6 mL)、针筒式过滤膜（PTFE，0.45 μm， 25 mm，美国Agilent公司）。

　　乙腈、环己烷、丙酮、乙酸乙酯、正己烷均为分析纯。无水Na2SO4（分析纯，650 ℃烘4 h）。乙草胺(纯度≥98%, Sigma公司）。

　　2.2  标准溶液的配制

　　准确称取（精确至0.1 mg）适量的乙草胺标准品，用正己烷配成浓度为1000 mg/L的标准储备溶液。于4 ℃冰箱中冷藏保存。根据需要稀释成适当浓度的标准工作溶液。

　　2.3  样品提取和净化

　　粮谷、坚果和禽肉组织样品：称取试样10．００ g（禽肉组织样品需要加入5 g无水Na2SO4，搅拌均匀）于100 mL塑料离心管中，加入50 mL乙腈，在匀浆器上匀浆2 min。以4000 r/min离心10 min，将上清液倒入浓缩瓶中（动物源性样品需要先用无水Na2SO4脱水），浓缩至干，用10 mL乙酸乙酯环己烷溶液（1∶1，Ｖ／Ｖ）溶解残渣，过膜并注入凝胶渗透色谱仪中，收集40～70 mL流出液，在40 ℃水浴上减压浓缩至干，用1 mL正己烷溶解残渣，供硅胶固相萃取柱净化。

　　海菜、松茸和洋葱：称取试样5．０ g（洋葱等含硫蔬菜需在700 W消解功率下微波消解40 s，恢复至室温）于100 mL玻璃离心管中，加入50 mL乙酸乙酯，在匀浆器上匀浆2 min。以4000 r/min离心10 min，将上清液倒入浓缩瓶中，浓缩至干，用1 mL正己烷溶解残渣，供硅胶固相萃取柱净化。

　　将上述各提取液或净化液注入硅胶固相萃取柱中，再用2×1 mL正己烷润洗盛样液容器，注入硅胶柱中，依次用10 mL正己烷、 5 mL 3%乙酸乙酯正己烷溶液和5 mL 5%乙酸乙酯正己烷溶液淋洗，再用15 mL 5%乙酸乙酯正己烷溶液洗脱，收集洗脱液于40 ℃水浴减压浓缩至干，用正己烷定容至5 mL，供气相色谱测定和气相色谱质谱确证。

　　2.4  气相色谱和气相色谱质谱条件

　　2.4.1  气相色谱条件  DB5石英毛细管柱(30 m × 0.32 mm, 0.25 μm)。载气：He，1.8 mL/min，恒流；柱温：60 ℃保持1 min，以15 ℃/min升至260 ℃，保持5 min，再升至300 ℃，后运行15 min；进样口温度：250 ℃；接口温度：325 ℃；不分流进样，0.75 min打开purge阀；进样量：1 μL。

　　2.4.2  气相色谱质谱条件  DB5MS 石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。载气：He，1.0 mL/min，恒流；柱温：60 ℃保持1 min，以15 ℃/min升至260 ℃，保持5 min，再升至300 ℃，后运行15 min；进样口温度：250 ℃；接口温度：280 ℃；不分流进样，0.75 min打开purge阀；进样量：1 μL；四极杆温度：150 ℃；离子源温度：230 ℃；电子能量：70 eV；数据采集模式：选择离子监测（SIM），选择离子为m/z 162、174、234、269（其丰度比100∶54∶24∶8，m/z 162为定量离子，其它均为定性离子）。

　　3  结果与讨论

　　3.1  提取剂的选择

　　粮谷类样品的提取通常使用乙腈、甲醇、丙酮等有机溶剂。分别使用上述有机溶剂进行提取，添加回收效果都很好。但丙酮提取的油脂最多，干扰杂质也最多，为后续的净化带来更多不便；甲醇和乙腈提取液中油脂都比较少，便于后续的净化。但甲醇对于一些极性基质干扰物如淀粉的提取能力更强，在减压浓缩后，淀粉残留在瓶壁上，干扰了提取液转移的重现性。而乙腈不存在类似的问题。所以最终确定粮谷和畜禽基质采用乙腈为提取剂。蔬菜等含水多的基质通常采用乙酸乙酯为提取剂。乙酸乙酯即对农药有好的溶解性，同时又可与水分层，有利于与样品进行分离。

　　3.2  净化条件的研究

　　本实验考察了10种不同基质，包括花生、大豆、玉米、小麦、元葱、海菜、鸡肉、猪肉、腰果及松茸。这些基质中都含有大量的干扰杂质，本实验根据乙草胺的物理化学性质，选择了PSA、Florisil、NH2、SCX和硅胶SPE柱进行净化实验。实验发现硅胶柱的净化效果最好，其次是NH2和SCX柱，再次是Florisil柱，PSA的效果最差。本实验使用硅胶SPE柱净化。

　　用乙草胺标准溶液上样至硅胶柱上，依次用10 mL正己烷、5 mL 3%乙酸乙酯正己烷和20 mL 5%乙酸乙酯正己烷淋洗，每5 mL收集1个馏分，进行GC分析，发现乙草胺在第6～20 mL 5%乙酸乙酯正己烷被洗脱下来。最终确定淋洗条件为依次用10 mL正己烷、5 mL 3%乙酸乙酯正己烷、5 mL 5%乙酸乙酯正己烷淋洗；洗脱液为15 mL 5%乙酸乙酯正己烷。用此淋洗和洗脱条件对各基质样品空白进行实验，用GC和GCMS检测，干扰杂质已经被淋洗掉，无杂质干扰。

　　由于元葱样品属于辛辣物质，有大量的含硫干扰杂质，如果按照通常的前处理方法，经过硅胶和SCX两个SPE柱净化，虽然除去了大部分干扰杂质，但仍对乙草胺的检测存在很大的干扰。本实验选用了微波消解的方法去除杂质。进行了4组消解功率/时间实验：540 W/40 s、700 W/20 s、700 W/30 s和700 W/40 s，发现700 W/40 s效果最佳，几乎没有任何干扰杂质，其它3组实验都有不同程度的干扰杂质出现。

　　3.3  基质效应的研究

　　基质效应对GC和GCMS方法检测农药残留量，特别对中等极性和强极性农药的影响异常突出，也是目前农药残留量检测的研究热点之一[7]。本实验在建立乙草胺检测方法的同时，以花生样品为例研究了基质效应的影响。依次将溶剂标准溶液、花生基质标准溶液与花生样品添加溶液各进样3次，再进样溶剂标准溶液3次，具体峰面积数据见表1。从表1发现，按上述进样顺序后，最后3次溶剂标准溶液的峰面积均值比开始进样3次的溶剂标准溶液均值增加了约一倍（73.1/35.3），说明基质效应对乙草胺的影响很大，按一定的进样顺序进样，可以非常有效降低基质效应的影响（由35.2/82.6减小至73.1/82.6）；按照样品和溶剂标准溶液参差进样后，溶剂标准溶液克服基质效应只能维持2针，第3次进样峰面积已经开始减小（75.4至76.7变化很小，至67.3变化很大）；3针基质标准的峰面积均值和最后3针的峰面积均值约有10%的差异（82.6和73.1），说明进样序列并不能完全解决基质效应问题；设定进样顺序的方法在日常检测任务比较多时可以使用，提高工作效率．准确定量时，必须配制基质标准溶液进行定量分析。

　　表1  进样顺序和基质效应的影响关系（略）

　　Table1  Influence of injection sequence and matrix effect

　　3.4  线性范围和检出限

　　将乙草胺储备标准溶液，用花生空白样品溶液稀释成浓度为0.01、0.02、0.04、0.08和0.16 mg/L的基质标准工作溶液，在选定的GC和GCMS条件下进行测定，进样量为1 μL，用峰面积对乙草胺浓度作图。GC方法乙草胺在0.01～0.16 mg/L范围内呈线性关系，其线性方程分别为y=5079.4x+23.4和y=510922x+581，相关系数分别为0.9998和0.9997。根据检出限浓度处信噪比S/N≥10可以计算出方法的定量限均为0.004 mg/kg。 0.01 mg/kg花生空白样品添加气相色谱图和气相色谱质谱图（SIM）见图1，乙草胺标准品全扫描质谱图见图２。

　　图1  花生空白样品添加0.01 mg/kg乙草胺的GC色谱图（a）和选择离子流图(b)（略）

　　Fig.1  GC(a) and SIM(b) chromatogram of peanut blank sample spiked of 0.01 mg/kg acetochlor

　　图2  乙草胺全扫描质谱图（EI）（略）

　　Fig.2  Scan (EI) mass spectrum of acetochlor

　　3.5  方法的回收率和精密度

　　采用不含乙草胺的花生、大豆、玉米、小麦、元葱、海菜、鸡肉、猪肉、腰果和松茸空白样品进行添加回收和精密度实验，添加水平为0.01、0.02和0.05mg/kg，按本方法进行提取和净化，用GC和GCMS联用仪测定。GC各种基质不同添加水平的回收率和精密度结果见表2。从表2可以看出，各种样品基质添加回收率均在70%～100%之间； 室内3个水平相对标准偏差在10%以内。GCMS法各种基质不同添加水平的回收率和精密度结果见表3。从表3可以看出，本方法各种基质添加回收率均在70%～102%之间，室内3个水平相对标准偏差在10%以内。

　　表2  气相色谱法检测样品的添加浓度及回收率数据（略）

　　Table 2  Fortified levels of acetochlor in various samples and its corresponding recoveries by GC

　　表3  气相色谱质谱法检测样品的添加浓度及回收率数据（略）

　　Table 3  Fortified levels of acetochlor in various samples and its corresponding recoveries by GCMS

　　3.6  实际样品测定

　　按照本方法对日常检测和残留监控的花生和大米样品进行测定，共检测样品142批，花生阳性样品2批，分别为0.014和0.008 mg/kg；大米样品均为阴性。

　　【参考文献】

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