高效液相色谱法测定五加茸血口服液中异嗪皮啶的含量

　　【摘要】  目的:测定五加茸血口服液中异嗪吡啶的含量。方法:用高效液相色谱法，以ODSC18柱（150mm×4.6mmID，5μm）为固定相，乙腈-0.1%磷酸溶液（20:80）为流动相，检测波长为342nm。结果:异嗪吡啶在18.752～187.52×10 -3 μg范围内呈现良好线性，相关系数r=0.9997。平均加样回收率95.26%，RSD为1.31%（n=6）。结论:方法简便、准确、重现性好。

　　【关键词】  异嗪皮啶;高效液相色谱法;刺五加

　　五加茸血口服液处方由刺五加、鹿茸血、鹿茸、维生素B 1 与几种辅料组成。具有健脑增髓，补血壮腰，安眠强胃，补肾强身，提神回春之功。用于体虚贫血，阳痿肾寒，神经衰弱等症。方中刺五加含有多种皂甙类，生物碱类化合物，主要成分之一是异嗪皮啶，其在药材中含量亦相对较易测定。本文以五加茸血中的主要有效成分异嗪皮啶为指标，采用高效液相色谱法，以乙腈、磷酸为流动相，测定其含量，该法简便、准确、精密度高、重现性好，为控制质量标准提供了可靠的依据。

　　1 仪器与试剂

　　日本岛津LC-10Avp系列高效液相色谱仪，SPD-10Avp紫外检测仪;CLASS-VP数据处理机;对照品异嗪皮啶（批号:0837-200203;供含量测定用，由中国药品生物制品检定所提供）。甲醇、乙腈为色谱纯，水为注射用水，基耸试剂均为分析纯。五加茸血口服液由吉林敖东药业集团延吉股份有限公司提供（批号061201、061202、061203、061204、061205、061206、061207、061208、061209、061210）

　　2 色谱条件

　　色谱柱:KromasilC18柱（150mm×4.6mmID，5μm）;流动相:乙腈-0.1%磷酸溶液（20:80）;检测波长:342nm;柱温:30℃;流速1.0ml.min;灵敏度:0.08AUFS。

　　3 线性范围的考察

　　精密称取异嗪皮啶对照品适量约10mg，置100ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释制刻度，摇匀，再精密吸取1ml置10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，配成每1ml含10μg的溶液，精密吸取异嗪皮啶（9.376μg.ml）对照品溶液2、4、8、12、16、20μl注样。记录色谱图，测定其峰面积，结果见表1。并以峰面积 值（A）对进样量（C）进行回归，得标准曲线方程。

　　表1 异嗪皮啶对照品测定结果（略）

　　以峰面积值（A）对进样量（C）作图，得一直线，A=3.31071e-007C，r=0.9997。结果表明，在18.752～187.52×10 -3 μg范围内，异嗪皮啶峰面积值与进样量有良好的线性关系。

　　4 精密度试验

　　精密吸取样品（061201）供试液10μl，重复进样5次，测定其峰面积，异嗪皮啶峰面积值的RSD=0.99%，结果见表2。

　　表2 精密度试验结果（略）

　　试验结果表明，精密度良好。

　　5 稳定性试验

　　取样品（061201）供试液分别于0、4、8h，分别进样10μl，测得样品中异嗪皮啶峰面积值的RSD=1.01%，结果见表3。

　　表3 稳定性试验果结（略）

　　试验结果表明，样品供试液在8h内稳定性良好。

　　6 重现性试验

　　按拟定的含量测定方法，对同一批样品（061201）制备样品供试液，测得峰面积值并计算含量，其异嗪皮啶峰面积值的RSD=0.84%;异嗪皮啶含量的RSD=0.85%，结果见表4。

　　表4 重现性试验结果（略）

　　注:A:异嗪比啶;A的浓度:9.376μg.ml;A的峰面积值:283181。（下同） 试验结果表明，本方法重现性良好。

　　7 回收率试验

　　精密量取已知含量的样品（061203）25ml，分别加入异嗪皮啶（25.52μg.ml）对照品溶液0.85ml，1.03ml，1.20ml按上述样品制备方法和色谱条件，制备加样回收供试品溶液并注入高效液相色谱仪，计算回收率，结果见表5。

　　表5 回收率试验结果（略）

　　试验结果表明，回收率在95%～100%之间，加样回收良好。

　　8 空白试验

　　精密量取除刺五加的阴性对照液50ml按上述样品制备方法和色谱条件，制备阴性对照溶液并注入高效液相色谱仪，见图1、2、3。结果表明在被测成分异秦皮啶的保留时间处无干扰。

　　图1 五加茸血阴性对照HPLC（略）

　　图2 异嗪皮啶对照品溶液HPLC（略）

　　图3 五加茸血供试品HPLC（略）

　　9 样品测定

　　对照品溶液的制备:精密称取异嗪皮啶对照品适量，加甲醇制成每1ml中含10μg的溶液，即得。供试品溶液的制备:精密量取供试品50ml，加水饱和醋酸乙酯提取4次（30，30，30，20ml），合并醋酸乙酯层，蒸干，残渣用甲醇定容至5ml，溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，即得。分别精密吸取对照品和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。测定法:分别精密吸取异嗪皮啶（9.376μg.ml）对照品溶液与10批样品供试液各10μl，按上述色谱条件测定，结果见表6。

　　表6 样品测定结果（略）

　　10 讨论

　　10.1 检测波长的选择 利用UV-2401PC型紫外分光光度仪，对异嗪皮啶对照品，在200～400nm波长下进行紫外扫描，结果在342nm波长处有最大吸收，因此选择342nm为检测波长。

　　10.2 提取溶剂的选择 用水饱和醋酸乙酯提取时，分层快，界面清晰，有利于快速测定，而且样品图谱中杂峰少，故选用水饱和醋酸乙酯为提取溶剂。

　　10.3 提取次数考察 分别用水饱和醋酸乙酯提取1，2，3，4，5，6次，结果表明提取4次以后，异嗪皮啶基本提尽。

　　10.4 流动相的选择 本文分别用4种流动相进行试验，结果表明流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液（80:20）时，效果最佳，柱压低，峰型尖锐，阴性无干扰［1-3］ 。

　　【参考文献】

　　［1］刘丽娟，张清波，张树杰.刺五加药材指纹谱（HPLC-FPS）分析方法研究及不同产地药材谱比较［J］.中成药，2001，23（11）:781-783.

　　［2］乔 菲，张清波，卢守奇，等.HPLC法测定刺五加制剂中异嗪皮啶的含量［J］.药物分析杂志，2000，20（3）:50.

　　［3］周国平，刘红宇，徐天华，等.血康口服液中异嗪皮啶含量的HPLC测定［J］.中成药，2000，22（3）:203-204.