高效液相色谱法测定胆汁中美罗培南的浓度

　　【摘要】  目的 采用高效液相色谱法(HPLC)测定胆汁中美罗培南的浓度。方法 色谱柱：Waters Symmetry C18(4.6mm×150mm，5μm)；流动相：乙腈∶0.05mol/L磷酸二氢钾(pH6.5，8∶92)；流速1.5ml/min；检测波长300nm；进样量20μl；柱温22.5℃。结果 美罗培南的胆药浓度在0.5～500.0μg/ml范围内，浓度与峰面积比的线性关系良好(r=0.9999)，胆汁中最低定量限为0.5μg/ml。HPLC方法回收率达96.87%以上(n=15)。日内RSD≤6.22%，日间RSD≤3.69%。结论 本方法简单、快速、准确，可用于美罗培南的浓度测定和药动学研究。

　　【关键词】  美罗培南； 高效液相色谱法； 胆汁

　　ABSTRACT  Objective  To establish a high performance liquid chromatography (HPLC) method to assay the concentration of meropenem in bile.  Methods  A Waters Symmetry C18 column(4.6mm×150mm, 5μm) was used. The mobile phase was a mixture of acetonitrile and 0.05mol/L potassium dihydrogen phosphate (pH6.5, 8∶92). The flow rate was 1.5 ml/min and the detection wavelength was at 300nm. Each sample size was 20μl and the temperature was 22.5℃.  Results  The linear calibration curve was obtained over the range 0.5～500.0μg/ml of meropenem in rabbit bile (r=0.9999). The limitation of determination was 0.5μg/ml. The recovery of the assay was beyond 96.87% (n=15). The intra-dry and inter-day RSDs did not exceed 6.22% and 3.69%, respectively.  Conclusion  The method was simple, convenient and precise for the determination of meropenem and its pharmacokinetics study in bile.

　　KEY WORDS  Meropenem;  HPLC;  Bile

　　美罗培南是新一代碳青霉烯类抗生素，具有广谱抗菌活性和β-内酰胺酶高稳定性，对常见胆道系统感染致病菌高度敏感［1］。目前国内仅有高效液相色谱法(HPLC)测定血及尿中美罗培南浓度的报道，未见美罗培南浓度在胆汁中测定的研究报道［2］。本研究采用的HPLC外标法为该药的胆汁药物浓度测定及药动学研究提供检测方法的参考。

　　1  材料与方法

　　1.1  仪器

　　Waters高效液相色谱系统：Waters1525双泵，Waters2487紫外检测器，SCL-10A进样器，Breeze色谱分析软件；XW-80A旋涡混合器(上海医科大学仪器厂)； 飞鸽TGL-16C台式高速离心机(上海安亭科学仪器厂)；微量采样器(上海求精生化试剂厂)；0.45um微孔滤膜(天津腾达过滤器件厂)。

　　1.2  药品和试剂

　　美罗培南(meropenem，商品名：美平，批号FK174，每支0.5g)和美罗培南对照品(含量87.6%，批号80549A)均为日本住友制药株式会社生产。乙腈为一级色谱纯；磷酸二氢钾、氢氧化钾为分析纯；双蒸水。

　　1.3  色谱条件

　　色谱柱：Waters Symmetry C18(4.6mm×150mm，5μm)；流动相：乙腈∶0.05mol/L磷酸二氢钾(pH6.5，8∶92)；流速1.5ml/min；检测波长300nm；进样量20μl；柱温22.5℃(室温)。

　　1.4  胆汁药物浓度测定方法

　　(1)对照品溶液的配制  精密称取美罗培南对照品11.42mg，置10ml棕色容量瓶中，以流动相溶解、稀释至刻度，摇匀，得1000μg/ml的美罗培南储备液一，精密量取1ml，以流动相稀释至10ml，即得100μg/ml的储备液二；再精密量取储备液一1ml，以流动相稀释至100ml，即得10μg/ml的储备液三。

　　(2)胆汁预处理［3］  精密取胆汁200μl，精密加入流动相至2ml，旋涡振荡，离心(5000r/min)10min，取上清液经微孔滤膜过滤后进样。

　　(3)标准曲线及检测限  取空白胆汁加入美罗培南标准储备液，使之成为含美罗培南500.0、100.0、50.0、25.0、10.0、5.0、1.0和0.5μg/ml的胆汁样品，按胆汁预处理方法处理后进样，采用外标法峰面积定量。结果以样品浓度(ρ)对色谱峰面积(A)进行线性回归。

　　(4)回收率试验  取空白胆汁加入美罗培南标准液，使各成为500.0、50.0和5.0μg/ml的胆汁溶液，按前述方法行胆汁预处理后进样，以胆汁样品色谱峰面积计算在不同浓度时美罗培南在胆汁中的回收率。

　　(5)精密度试验  同上法配制高、中、低三个浓度的胆汁溶液各5份，在同一天内测定，计算方法的日内精密度。其余样品置-20℃冰箱内保存，此后在不同天同法测定高、中、低三个浓度的胆汁样品，计算日间的变异系数，即为日间精密度。

　　2  结果

　　2.1  色谱条件的选择

　　美罗培南含量和有关物质检查较多采用HPLC法测定，目前仍未被我国药典收录，国内也无测定胆汁样品中该药浓度的报道。为保证方法的通用性，采用C18柱为实验用柱。参考本类物质HPLC测定法，在确保所有杂质峰与主峰完全分离的情况下，采用乙腈∶0.05mol/L磷酸二氢钾(pH6.5，8∶92)为流动相。美罗培南的紫外扫描结果表明在300nm波长处有最大吸收，故选择300nm为检测波长。采用外标法较内标法更简单、方便、直观，经过系列检测方法学验证符合检测要求(2.2～2.5项)。

　　2.2  美罗培南测定方法的专属性

　　在上述色谱条件下，空白胆汁、对照品溶液、空白胆汁加对照品溶液、动物静脉注射美罗培南后的胆汁等4种试验样品分离效果良好，无内源性物质干扰(Fig.1)。外科临床抗菌治疗用药是以简单为原则的，通常只选用单一抗生素，美罗培南是新一代碳青酶烯类抗生素，具有超广谱杀菌活性，患者很少采用联合用药，临床用药的复杂性和其他药物产生干扰的可能性较小，故此专属性检测有实用价值。

　　2.3  标准曲线及检测限

　　美罗培南在0.5～500.0μg/ml浓度范围内胆药浓度(ρ)对色谱峰面积(A)的线性关系良好，回归方程：

　　A=2217.49ρ-3215.42  r=0.9999

　　胆药浓度最低定量限为0.5μg/ml，提示此标准曲线用于美罗培南色谱峰面积计算胆药浓度具有很高的相关性和准确性，而且胆汁药物浓度只要达0.5μg/ml上即可准确定量。

　　2.4  回收率

　　美罗培南500.0、50.0和5.0μg/ml三种浓度的回收率分别为99.58%、96.87%和110.28%(Tab.1)。回收率是实测浓度和标准浓度的比值， 反映了测定方法的可重复性和检测结果的符合程度，结果显示本实验回收率很高，符合检测要求。

　　2.5  精密度

　　美罗培南500.0、50.0和5.0μg/ml三种浓度的日内精密度RSD(%)分别为0.69、2.28和6.22；日间精密度RSD(%)分别为1.33、4.78和3.69(Tab.2，Tab.3)。精密度是HPLC测定方法的精密程度，RSD越小日内精密度越高；反之精密度越低。实验结果显示，该法测定美罗培南的精密程度高，RSD均少于10%，符合检测方法学要求。

　　2.6  家兔胆汁药物浓度测定

　　实验用健康雄性家兔1只，禁食12h，用3%戊巴比妥腹腔注射麻醉后行胆总管造瘘术。留取空白胆汁后，静脉注射美罗培南75mg/kg，给药结束后分别在0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3和4h收集胆汁1.5ml进行测定(胆药浓度数据见Tab.4)。结果显示家兔静注美罗培南后胆汁中药物浓度达峰时间很快，给药结束后15min即达峰，峰浓度为78.64μg/ml，之后美罗培南的胆药浓度随时间而迅速降低，30min时胆药浓度已下降到峰值一半以下。用药后4h，家兔胆汁中已未能检测到美罗培南色谱峰，提示美罗培南在胆汁中消除较快。但由于实验样本数小，本浓度测定结果只能作为参考；如需进一步了解美罗培南在胆汁中的药动学规律，则须加大样本量。

　　3  讨论

　　(1)治疗胆道感染尤其是急性化脓性重症胆管炎必须使用能在胆道中达到并维持较高有效浓度的抗生素［1，3，4］。美罗培南对胆道致病菌高度敏感，但目前国内尚无关于美罗培南在胆汁中的浓度测定方法资料。目前美罗培南测定方法主要有有微生物法［5］、旋光法［6］、高效毛细管电泳法［7］和HPLC法［8］等。微生物法误差较大， 相对误差可达10%～25%，费时、操作较繁杂；旋光法灵敏度较低，且干扰大；高效毛细管电泳法灵敏度差，不适于生物样本中药物浓度的测定；前三种测定方法有较大的局限性，准确性受到一定的限制。HPLC法高效、快速、准确、灵敏度高，且重现性好［9］。

　　(2)本文采用HPLC法测定胆汁中的美罗培南浓度。测定方法的胆汁预处理简单，无需特殊处理。由于流动相采用了乙腈， 因此对胆汁样品预处理时也采用了含有乙腈的流动相来沉淀去除胆汁中的蛋白等杂质。结果胆汁中美罗培南出峰干净利落，峰形良好，分离完全，无杂峰干扰。该处理方法较其他方法(如蒸馏、浓缩、吸附法)明显简便，快捷，也使本测定方法有更强的专属性。本研究采用外标法峰面积定量，经济简便，且回收率和精密度高，具有高效、快速、准确、灵敏度高、重现性好的优点，可作为美罗培南的胆汁药物浓度测定和药动学研究的可靠检测方法。

　　【参考文献】

　　［1］ 郑惊雷，梁力建，赖佳明. 胆道感染病原菌及其对抗生素敏感性变化的研究［J］. 中国实用外科杂志，2005，25(2)：86～88.

　　［2］ 刘松青，林彩，代青，等. HPLC法测定人血清及尿中美洛培南浓度［J］. 中国抗生素杂志，2003，28(9)：526～528.

　　［3］ 郑惊雷，梁力建，黄文静，等. 头孢曲松钠在胆汁中的浓度测定和药动学的实验研究［J］. 中国药学杂志，2005，40(20)：1569～1571.

　　［4］ Westphal J F, Brogard J M. Biliary tract infections——A guide to drug treatment［J］. Drugs,1999,57(1):81～91.

　　［5］ Mendez A S, Weisheimer V, Oppe T P, et al. Microbiological assay for the determination of meropenem in pharmaceutical dosage form ［J］. J Pharm Biomed Anal,2005,37(4):649～653.

　　［6］ 殷果，李玉兰，邓颖，等. 旋光法测定注射用美罗培南的含量［J］. 医药导报，2004，23(11)：865～866.

　　［7］ Mrestani Y, Neubert R, Nagel F. Capillary zone electrophoresis determination of meropenem in biological media using a high sensitivity cell ［J］. J Pharm Biomed Anal,1999,20(6):899～903.

　　［8］ Robatel C, Buclin T , Eckert P, et al. Determination of meropenem in plasma and filtrate-dialysate from patients under continuous veno-venous haemodiafiltration by SPE-LC ［J］. J Pharm Biomed Anal,2002,29(1):17～33.

　　［9］ 徐叔云，卞如濂，陈修，主编. 药理实验方法学(第三版)［M］. 北京：人民卫生出版社，2002，740～742.