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【摘要】目的建立安痛藤中羽扇豆醇含量的测定方法。方法采用高效液相色谱（HPLC）法，色谱柱为diamonsil C18(5 μm，250 mm×4.6 mm)，流动相为甲醇∶水=98∶2,流速1.0 ml·min-1，检测波长206 nm，柱温为30℃。结果羽扇豆醇在0.316～3.16 μg范围内与峰面积有良好线性关系,r=0.999 5，平均回收率为97.82%，RSD为2.49%。结论该方法测定安痛藤中羽扇豆醇含量快速、简便、准确、可靠。
【关键词】 高效液相色谱 安痛藤 羽扇豆醇
安痛藤为葡萄科白粉藤属植物苦朗藤Cissus assamica (Laws.)的藤茎，具有祛风除湿、散瘀、拔毒作用，主治风湿痹痛，跌打扭伤，痈疽肿毒，为江西等地治疗类风湿性关节炎的习用药材。它主要分布在我国中南、西南地区及江西、福建、西藏等地［1］。药理实验表明，安痛藤具有较好的抗类风湿作用［2］。笔者已从安痛藤中分离鉴别羽扇豆醇等多个成分。据文献报道，羽扇豆醇在动物实验中有抗炎［3］、抗氧化［4］、促进皮肤愈合［5］等药理作用，故初步判断羽扇豆醇是安痛藤中有效成分之一（药理实验正在进行中）。为此,拟将羽扇豆醇作为安痛藤中的质量控制指标之一。目前，羽扇豆醇含量测定方法主要有薄层扫描法［6］、高效液相质谱法［7］，还未见HPLC方法测定羽扇豆醇含量的报道。为使质控方法有较好的通用性和测定结果的准确性，本实验拟用HPLC方法对其进行含量测定，希望能为安痛藤的质量标准的制定提供科学依据。
1 仪器与试药
Agilent1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Diamonsil C18(5 μm，250 mm×4.6 mm;DIKMA公司)；KQ3200型超声仪；羽扇豆醇对照品(自制,归一化含量99.80%)；甲醇为色谱纯，其它试剂均为分析纯，水为超纯水；安痛藤药材采于江西赣南地区，由江西中医学院刘庆华老师鉴定为葡萄科白粉藤属植物苦朗藤Cissus assamica (Laws.)。
2 方法与结果
2.1 色谱条件Diamonsil C18(5 μm,250 mm×4.5 mm)色谱柱,甲醇∶水(98∶2)为流动相,柱温30℃,流速1 ml·min-1,检测波长206 nm；羽扇豆醇对照品进样量和安痛藤供试液进样量20 μl。在上述色谱条件下, 羽扇豆醇与其它成分分离良好,理论塔板数以羽扇豆醇峰计算不低于5 000；分离度接近于1.5,基本实现基线分离。结果见图1～2。
2.2 对照品溶液的制备精密称取羽扇豆醇对照品适量，置于25 ml量瓶中,加甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，即得（0.158 mg/ml）。
2.3 供试品溶液的制备取安痛藤粉末(过60目)约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇40 ml，称定重量，超声30 min，放冷，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液20 ml，水浴蒸干，用氯仿溶解(2，2，1 ml)，合并氯仿液上1.5 g硅胶柱，用氯仿洗脱，收集洗脱液8 ml，蒸干，用甲醇溶解并定容至2 ml，0.45 μm滤膜滤过，取续滤液，即得。
图1 羽扇豆醇对照品色谱图（略）
图2 安痛藤供试液色谱图（略）
2.4 线性关系的考察精密吸取对照品溶液1，2，4，6，8，10 ml置于10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，制成浓度为15.8，31.6，63.2，94.8，126.4，158 μg·ml-1羽扇豆醇对照品溶液，分别进样20 μl。以羽扇豆醇的质量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归， 回归方程为：Y=383.54X+ 26.066，r=0.999 5。结果表明，羽扇豆醇在0.316～3.16 μg范围内与峰面积呈良好线性关系。
2.5 稳定性实验取安痛藤约2 g，精密称定，按供试液制备项制备供试液，进样20 μl/次，共6次，分别在0，4，8，12，16，24 h进样并记录峰面积值。计算结果显示：6次羽扇豆醇含量测定结果基本不变，平均值为0.016 2 %，RSD=1.20%，表明供试液至少在24 h内稳定。
2.6 精密度实验精密吸取安痛藤供试液，连续进样6次，20 μl/次，6次进样测得羽扇豆醇含量平均结果为0.016 3 %,RSD=1.33%，表明本实验方法精密度良好。
2.7 重复性实验取安痛藤粉末6份，每份约2 g，精密称定，按供试液制备项制备供试液，进样20 μl，记录峰面积值。6份样品羽扇豆醇含量平均值为0.016 0%，RSD=2.41%，结果表明本实验方法重复性良好。
2.8 加样回收实验取安痛藤粉末(过60目)6份，每份约2 g，精密称定，按供试液制备项制备，在“精密吸取续滤液20 ml”后分别精密加入羽扇豆醇对照品溶液1 ml（含羽扇豆醇为0.122 3 mg），继续制得供试液。进样20 μl/次，每份供试品溶液进样3次。结果见表1。
结果显示，用HPLC法测定安痛藤中羽扇豆醇的含量，回收率结果令人满意。
2.9 系统适应性实验选择了3种色谱柱：Diamonsil C18(5 μm，250 mm×4.6 mm)，Hypersil ODS2 (5 μm，250 mm×4.6 mm,大连依利特)色谱柱和Eclipse XDB-C18(5 μm，250 mm×4.6 mm，安捷伦公司)色谱柱，按本法测定安痛藤药材中羽扇豆醇的含量，测定结果基本一致，均值为0.0162%,RSD为2.49%。表明本法适应性较好。
表1 加样回收率实验结果（略）
2.10 样品的含量测定取不同采收期的安痛藤样品按“2.3”项下制备供试品溶液，进样量20 μl，测定供试品中羽扇豆醇的含量。结果见表2。
表2 安痛藤不同采收期羽扇豆醇的含量测定（略）
结果显示，不同采收期安痛藤样品中的羽扇豆醇含量存在较大的差异。由于样品来源于山区，受到人为因素的影响较小，主要影响因素可能在于日晒与水分等自然条件。2004,2005,2006年采集的样品中，以20051125采收的羽扇豆醇含量最高。
3 讨论
3.1 供试品提取方法的选择羽扇豆醇溶于氯仿、略溶于甲醇和乙醇，采用氯仿、乙醇、甲醇3种提取溶剂进行比较，发现氯仿反而不能提出羽扇豆醇，可能是因为氯仿的渗透性能差。而乙醇在提取羽扇豆醇时带来了较多的杂质成分，使基线升高，羽扇豆醇峰受到干扰而不能较好地分离。同时,也对超声和回流两种提取方法进行提取条件比较实验，考察了不同超声提取时间(10，20，30，40，50，60 min)和不同粒度的药材粉未（20，40，60，80，100目）对提取效果的影响。结果表明，过60目药材粉末，用甲醇超声提取30min较为适宜。
3.2 样品预处理由于羽扇豆醇在安痛藤中含量较低，极性较大的成分较多，使得羽扇豆醇峰的峰高相对较低；另外，羽扇豆醇的色谱峰受到邻近峰的干扰不易分离。所以，我们用正相硅胶柱对样品作了预处理，使得一些大极性的成分被吸附在硅胶上，并且去除了部分干扰成分，提高了羽扇豆醇色谱峰的相对峰面积和分离度，并使峰形得到改善。
【参考文献】
［1］ 张叶青，谢一辉，黄丽萍.白粉藤属植物化学成分及生理活性的研究进展［J］.时珍国医国药，2006，17（1）：107.
［2］ 黄丽萍，谢一辉，肖百全，等.安痛藤对大鼠佐剂性关节炎的影响［J］.时珍国医国药，2006，17（11）： 2139.
［3］ T. Geetha and P. Varalakshmi. Anti-inflammatory activity of lupeol and lupeol linoleate in rats［J］.Journal of Ethnopharmacology，2001,76(1):77.
［4］ Varatharajan Sudhahar, Sekar Ashok Kumar.et al. Remedial effect of lupeol and its ester derivative on hypercholesterolemia-induced oxidative and inflammatory stresses［J］.Nutrition Research，2007,27(12):778.
［5］ Dalale Naaimi，Caroline Baudouin.etc. Lupeol stimulates the production of high-quality type I collagen in human skin through HSP47 induction［J］.Journal of the American Academy of Dermatology，2008,58(2): AB62.
［6］ 马雨林 ，张 艳. 薄层扫描法测定血水草地上部分中羽扇豆醇乙酸酯的含量［J］.湖南文理学院学报(自然科学版)，2005，17(4):26.
［7］ Mitja Martelanc, Irena Vovk,Breda Simonovska. Determination of three major triterpenoids in epicuticular wax of cabbage (Brassica oleracea L.) by high-performance liquid chromatography with UV and mass spectrometric detection［J］.Journal of Chromatography A,2007,1164(14): 145.