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【摘要】 目的建立重庆道地药材青蒿高效液相色谱（HPLC）指纹图谱研究方法。方法采用反相高效液相色谱法，测定青蒿药材指纹图谱，色谱条件为：色谱柱：Shimadzu C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水梯度洗脱；流速：1.0 ml·min-1；检测波长：206 nm；柱温：25℃。结果建立了重庆道地药材青蒿指纹图谱标准。结论该指纹图谱方法简便、快速、重现性好，可作为青蒿药材的一项质控指标。
【关键词】 青蒿 指纹图谱 模糊模式识别 高效液相色谱
Abstract：ObjectiveTo establish an HPLC fingerprint analysis method for identification of Artemisia annua L. from Chongqing. MethodsThe fingerprint was determined by HPLC. The analysis was carried out on Shimadzu C18 column(150 mm×4.6 mm,5 μm).The mobile phase was CH3OH-H2O（gradient elution）with a flowrate of 1.0 ml·min-1 at 206 nm and the seperation was performed at 25℃．ResultsThe standard of fingerprint in Artemisia annua L was established. Conclusion The method is simple,fast and repeatable. It can be used in quality assessment of Artemisia annua L.
Key words：Artemisia annua L； Fingerprint； Fuzzy pattern recognition； HPLC
青蒿为菊科植物黄花蒿Artemisia annua L.的地上部分,味苦、微辛，性寒。具有清热、解暑作用。用于瘟病、暑热、骨蒸劳热、疟疾、痢疾、疮痒等［1］。生于旷野、山坡、河岸，分布于全国各地，是重庆道地药材之一。本实验利用HPLC法建立了以青蒿素为参照峰的重庆道地药材指纹图谱，利用模糊模式识别软件计算各批药材相似度，为建立符合规模化生产的青蒿药材基地提供更多的科学依据。
1 仪器与试药
Waters液相色谱仪(Waters1525泵、Waters2487紫外检测器)； SK2200LH超声仪（昆山市超声仪器公司）；H·S·G-IIC-4 电热恒温水浴锅（上海仪表供销公司）；METTLER AE 240 电子分析天平。
甲醇（色谱纯）；乙醇（药用）；其他试剂均为市售分析纯；水为纯净水，青蒿素对照品（批号0202-9501，供含量测定用）由中国生物制品检定所提供。
共收集青蒿药材样品15批，均为重庆酉阳栽培品种，经本校傅善权副教授鉴定为黄花蒿Artemisia annua L.的地上部分。
2 方法与结果
2.1 对照品溶液的制备取青蒿素对照品适量，用甲醇溶解制成1.10 mg·ml-1的对照溶液，作为参照物。
2.2 供试品溶液的制备称取青蒿药材10 g，加50 ml乙醇回流提取3 h，滤过，再加25 ml乙醇同法处理两次，滤过，合并滤液，减压浓缩至无乙醇，加入相同体积的醋酸乙酯萃取3次，合并萃取液，浓缩至干，各取一定量，制成2.5 mg·ml-1的溶液，0.45 μm滤膜滤过，作为供试品溶液。
2.3 色谱条件参考文献［2，3］并经筛选确定其色谱条件为色谱柱：Shimadzu C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-水（B）梯度洗脱（见表1）；流速：1.0 ml·min-1； 检测波长206 nm；柱温：25℃，青蒿色谱图见图1。
表1 流动相梯度洗脱程序（略）
图1 青蒿素参照物与青蒿药材HPLC图（略）
2.4 方法学考察与结果
2.4.1 稳定性实验取“2.2”项供试样品溶液，在上述色谱条件下，分别于0，2，4，8，16 h进样10 μl，记录指纹图谱。各共有峰的保留时间的RSD为1.08%～2.71%，百分面积RSD为1.15%～2.82%，百分高度RSD为1.13 %～2.94%，符合中药指纹图谱研究的技术要求，结果表明样品溶液在16 h内稳定。
2.4.2 精密度实验取“2.2”项供试样品溶液，在上述色谱条件下，连续进样5次，记录指纹图谱。结果表明，各共有峰的保留时间的RSD为1.51% ～2.91%，百分面积的RSD为1.94%～2.89%，百分高度的RSD为1.47%～2.98%，符合中药指纹图谱研究的技术要求，表明该仪器精密度较好。
2.4.3 重现性实验 取供试样品6份，按“2.2”项供试样品溶液制备方法制得供试样品溶液。在上述色谱条件下，分别进样10μl，记录指纹图谱。结果表明，各共有峰的保留时间RSD为1.23%～2.82%，百分面积RSD为1.02%～2.78%，百分高度RSD为0.98％～2.97％，符合中药指纹图谱研究的技术要求，表明样品重复性较好。
2.4.4 青蒿样品指纹图谱模式标准的建立分别取10批不同批号的青蒿药材，按供试品制备方法制备，在上述色谱条件下各进样10 μl，记录色谱图。经比较10批样品的色谱图，其中有11个峰为共有指纹峰。选择相对保留时间、相对峰面积、相对峰高为特征参数，计算各特征参数平均值，建立指纹图谱模式标准，见表2。
表2 10批青蒿药材指纹图谱模式标准（略）
2.4.5 样品测定与相似度计算取5批样品, 在相同色谱条件下测定，采用广义夹角余弦［4］，计算样品各共有色谱峰与标准模式中对应的色谱峰的相似度。结果各指纹图谱的相似度均大于0.9，即各批样品与所建立的模式标准有较好的相似性（见表3）。
3 讨论
本实验对供试品溶液的制备方法、色谱条件进行了筛选。通过对不同提取溶剂、提取方法进行比较，以文中供试品的制备方法，所得指纹图谱峰数较多。以甲醇-水梯度洗脱分离效果较好，能使样品中各色谱峰较好地分离且出峰较多。对青蒿素的测定，大多采用衍生化方法，本文采用190～400 nm波长扫描确定其最大吸收波长为206 nm，避免了衍生化方法的繁琐，使样品处理更方便、快捷。
采用相对保留时间、相对峰面积、相对峰高等定量表征参数对指纹图谱进行分析，以10批不同批次药材制定了青蒿药材指纹图谱模式标准。在此基础上，采用模糊模式识别方法评价5批样品各共有峰的相似度均大于0.9，符合中药指纹图谱研究的技术要求。
表3 5批样品相似度计算结果（略）
该方法具有稳定、重复性好的特点，是一种理想的指纹图谱分析方法，可作为青蒿药材的质控指标。
【参考文献】
［1］ 肖培根. 新编中药志（Ⅲ）［M］.北京：化工出版社,2002：154.
［2］ 刘丽芳，王 茜，李海燕，等.柱前衍生-RP-HPLC法测定青蒿中青蒿素的含量［J］.中国野生植物资源，2004，23（6）：60.
［3］ 张 萍，张子忠.山东引种黄花蒿青蒿素含量分析［J］.山东中医药大学学报，2001，25（3）：229.
［4］ 楼世博，孙 章，陈化威，等. 模糊数学［M］.北京：科技出版社，1985：105.