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【摘要】 目的建立高效液相色谱（HPLC）法测定止痢宁片中苦参碱的含量。方法采用C18柱（150mm×4.6 mm， 5 μm），以乙腈－水（1 000 ml水加2 ml三乙胺，用磷酸调pH值至3.0）（4∶96）为流动相，流速为1.0 ml/min，柱温为40℃，检测波长为220 nm。结果在建立的色谱条件下，苦参碱与杂质能完全分离，苦参碱线性范围为18.712～299.392 μg/ml （r＝0.999 9），平均回收率为101.60％，RSD为 0.8％。结论此法简便准确，专属性好，可用于止痢宁片中苦参碱的含量测定。
【关键词】 止痢宁片 苦参碱 高效液相色谱法
止痢宁片是由穿心莲、苦参、木香组成的半浸膏片，具有清热祛湿、行气止痛等功效［1］，穿心莲和苦参均为其中的主药。本品已收载于卫生部《药品标准中药成方制剂》第四册，其质量标准中未有含量测定项。国内已有关于该药中脱水穿心莲内酯含量测定的研究报道，而未见关于苦参碱含量测定的报道，为更好地控制止痢宁片的质量，本课题组研究建立了HPLC法测定制剂中苦参碱的含量的方法，该方法简便、准确、专属性好，能有效地控制制剂的内在质量。
1 仪器与材料
高效液相色谱仪：Agilent 1200（带有Agilent化学工作站）；十万分之一电子天平（Sartorius cp225D ）。苦参碱对照品（批号：110805-200306，供含量测定用），由中国药品生物制品检定所提供。乙腈为色谱纯，水为蒸馏水，其他试剂为分析纯。
止痢宁片分别为A：陕西白云制药有限公司（批号：070501）；B：修正药业集团股份有限公司（批号：070603）；C：四川禾邦阳光制药有限责任公司（批号：070801）；D：吉林省跨海生化药业制造公司（批号：20070402）。
2 方法与结果
2.1 色谱条件与系统适用性 色谱柱：奥泰ODS C18（150mm×4.6 mm， 5 μm）；流动相：乙腈－水（1 000 ml水加2ml三乙胺，用磷酸调pH值至3.0）（4：96）；流速：1.0 ml/min；检测波长220 nm；柱温40℃；进样量10 μl。苦参碱的保留时间为5.0min，与邻峰分离度大于1.5，理论板数不低于2 500。阴性对照无干扰。色谱图见图1。
2.2 溶液的配制
2.2.1 对照品溶液 称取苦参碱对照品约23 mg，置50 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
2.2.2 供试品溶液 取本品10片，精密称定，研细，取约1片量，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 ml，浓氨1.0 ml，密塞，称定重量，超声处理20 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
a对照品溶液； b供试品溶液； c阴性对照溶液； 1.苦参碱
图1 苦参碱的HPLC图
2.2.3 阴性对照液 按止痢宁片处方，制成缺苦参的阴性样品，照“2.2.2”项制备方法制得阴性对照液。
2.3 线性关系考察 精密吸取苦参碱对照品储备液1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，16.0 ml，置25 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。分别取稀释液，进样10μl，以苦参碱浓度（单位：μg/ml）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得苦参碱的回归方程为：A=3.556 9C-10.812，r=0.999 9。苦参碱在18.712 ～299.392 μg/ml范围内线性关系良好。
2.4 精密度实验精密吸取苦参碱对照品储备液6.0 ml，置25 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度。在上述色谱条件下连续进样6次，测定峰面积， RSD为1.7％（n=6）。
2.5 稳定性实验取供试品溶液，分别于配制后0，2，4，8 h测定，苦参碱峰面积的RSD为1.7％，表明样品溶液在8 h内稳定。
2.6 重复性实验取同一批样品，制备5份供试品溶液，在上述色谱条件下测定，苦参碱的含量分别为3.54，3.58，3.48，3.50，3.42 mg/片，平均含量为3.50 mg/片，RSD为1.6％，表明本方法重现性良好（n=5）。
2.7 加样回收率实验精密称取已知含量的样品，共6份，分别精密加入苦参碱适量，按“2.2.2”项供试品溶液制备方法制备6份溶液，依上述色谱条件测定，计算回收率，结果见表1。
2.8 样品测定取4个厂家的样品，分别按“2.3”项下的方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，以外标法计算样品中苦参碱的含量，结果见表2。 表1 加样回收实验结果表2 样品测定结果
3 讨论
苦参中氧化苦参碱的含量远远高于苦参碱，达到20倍以上［2］，但氧化苦参碱不稳定，经加水煎煮转变为苦参碱 ［3］，因在本品的生产工艺中苦参为加水煎煮提取，所以以苦参碱的含量作为控制指标。
3.1 色谱条件的选择本实验分别对3个流动相系统进行考察，①乙腈－磷酸盐缓冲液（磷酸二氢钾1.36g，加1 ml三乙胺，加水至1 000 ml，磷酸调pH5.5） ②乙腈－水（1 000 ml水加3ml三乙胺，用磷酸调pH值至3.5）（4：96） ③乙腈－水（1 000 ml水加2 ml三乙胺，用磷酸调pH值至3.0）（4：96）。结果表明，流动相①、②系统中苦参碱峰拖尾严重，峰形很差，而流动相③系统中苦参碱峰形较好，苦参碱色谱峰能与相邻峰达到基线分离，所以选择流动相③系统。
实验中，柱温分别设定为25，35，40，45℃，结果柱温为45℃时苦参碱峰与相邻杂质峰未达到基线分离，在25，35，40℃时均可达到基线分离，且柱温在40℃时，不但色谱峰峰形佳，而且保留时间相对来说较适宜，所以选择柱温为40℃。
3.2 提取方法的选择 根据游离生物碱在碱性条件下易溶于有机溶剂的特性，选用浓氨试液将生物碱提出。实验中考察了加浓氨0.5，1.0，1.5，2.0 ml 4种方法，结果加浓氨1.0 ml较0.5 ml测得的苦参碱含量高，与1.5，2.0ml无明显差异，故选择加浓氨1.0 ml。因苦参碱易溶于甲醇，实验比较了加甲醇25，50，75 ml，结果显示甲醇50 ml较25 ml提取的苦参碱含量高，与75 ml无显著差异，故选择加甲醇50 ml。超声提取时间分别设定为15，20，30 min，以20 min提取最为理想。
实验结果表明，不同厂家生产的样品中苦参碱含量差异很大，最高与最低相差近250%，可能与制剂生产工艺、药材的产地、生长年限、采集时间等因素有关。建议在该药质量标准中增加含量测定项，以达到控制质量的目的。
【参考文献】
［1］ 中华人民共和国卫生部药品标准［S］.中药成方制剂第四册 WS3-B-0703-91.
［2］ 田 娟，王智民，王维皓，等.HPLC测定苦参药材中苦参碱和氧化苦参碱的含量［J］.中国实验方剂学杂志，2006，12(2):23.
［3］ 贾敏鸽，孙文基.苦参及其复方中苦参碱与氧化苦参碱的转化研究［J］. 药物分析杂志，2003，23（2）：90.