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【摘要】目的建立百金花中龙胆苦苷（gentiopicrin）和咖啡因（caffeine）的高效液相色谱测定方法。方法采用ODS柱，流动相为甲醇-水（30∶70），检测波长273 nm。结果该法回收率龙胆苦苷为97.76％，咖啡因为102.30％；RSD龙胆苦苷为2.97％，咖啡因为1.75％（n=6）。结论该方法建立同一色谱条件下测定百金花中龙胆苦苷和咖啡因，简便、准确，为百金花蒙药植物资源的进一步开发提供了可靠的依据。
【关键词】 百金花 龙胆苦苷 咖啡因 高效液相色谱
Abstract：ObjectiveTo establish an HPLC method for determination of gentiopicrin and caffeine in Herba Centaurii.MethodsThe separation was performed on Kromasil C18 Column(250 mm, 4.6 mm×5μm) and the mobile phase was methanol-water(30∶70). Gentiopicrin and caffeine was detected at 273nm. ResultsThe recovery rate of gentiopicrin and caffeine was 97.70% and 102.30%, respectively. ConclusionThis method is rapid and accurate for determination of gentiopicrin and caffeine. It can be used for further exploitation of Mongolian herbal resources.
Key words：Herba Centaurii； Gentiopicrin； Caffeine； HPLC
百金花为龙胆科植物百金花Centaurium meyeri (Bunge) Druce的干燥带花全草，蒙文名“森达日阿－其其格”，为一蒙古族习用药材，具有清热、退黄、利胆功效，民间用于治疗肝热、胆热、黄疸、头痛等症［1］。百金花为民间习用，其化学成分及分离、测定方法也未见文献报道。本研究首次采用HPLC法测定百金花中龙胆苦苷和咖啡因含量。
1 仪器与材料
1.1 仪器 Agilent1100液相色谱仪，Agilent1100紫外检测器，AS3120超声波清洗机，AG135电子分析天平。
1.2 试药 龙胆苦苷对照品和咖啡因对照品均由中国药品生物制品检定所购入，水为双蒸水，甲醇为色谱纯，其它试剂均为分析纯。
1.3 药材 百金花药材采自内蒙古自治区鄂尔多斯市，由内蒙古大学生命科学学院赵立清博士鉴定为百金花的Centaurium meyeri(Bunge) Druce的带花全草。
2 方法与结果
2.1 色谱条件Kromasil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm, 100A）；流动相为甲醇-水（30∶70）； 检测波长273 nm；体积流量1.0 ml/min；柱温为室温；进样量20 μl。在此条件下供试品中龙胆苦苷成分、咖啡因成分能与其他成分达到较好分离（见图1）。
图1 对照品（a）及样品（b）的HPLC色谱图（略）
2.2 对照品溶液制备精密称取龙胆苦苷对照品和咖啡因对照品适量，分别加流动相制成每毫升含咖啡因100 μg和龙胆苦苷200 μg的溶液。精密量取上述对照品溶液各2.0 ml，置10 ml量瓶中，加流动相制成每毫升含咖啡因20 μg和龙胆苦苷40μg的混合对照品溶液。
2.3 供试品溶液制备取本品粗粉约0.2 g，精密称定，置25 ml量瓶中，加入流动相适量，超声处理20 min，放冷，流动相补足至刻度，摇匀，滤过，续滤液即为供试品溶液。
2.4 标准曲线制备取咖啡因对照品约10 mg，龙胆苦苷对照品约10 mg，精密称定，分别置100 ml和50 ml量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取咖啡因对照品溶液0.25，0.5，1.0，2.5，5.0 ml和龙胆苦苷对照品溶液0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 ml，分别置于25 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，分别测定峰面积。以对照品峰面积Y为纵坐标，相应对照品的量X(μg)为横坐标，得龙胆苦苷回归方程为：Y=3E+06X－7 974.9，r=0.999 9，线性范围0.082 8～1.656 3 μg；咖啡因回归方程为Y=7E+06X－19 651，r=0.999 9，线性范围0.021 568～0.431 36 μg。
2.5 精密度实验对照品混合溶液，重复进样5次，测定峰面积。结果龙胆苦苷峰面积RSD为1.12％，咖啡因峰面积RSD为1.27％。
2.6 稳定性实验取同一供试品溶液，间隔一定时间进样，依法测定峰面积。结果咖啡因峰面积RSD为1.03%（n=5）；龙胆苦苷峰面积RSD为0.32%（n=5）。结果供试品溶液在8 h内稳定。
2.7 重复性实验取同一批药材5份，按供试品溶液制备方法操作，分别测定龙胆苦苷、咖啡因峰面积，计算含量。结果龙胆苦苷含量RSD为2.09%，咖啡因含量RSD为0.48%。
2.8 加样回收实验精密称取已知含量的药材样品0.1 g，分别精密加入一定量的龙胆苦苷及咖啡因对照品，按供试品溶液制备方法进行测定并计算回收率，结果龙胆苦苷平均回收率为97.76％，RSD为2.97%(n=6)，咖啡因平均回收率为102.30％，RSD为1.75%(n=6)。
2.9 样品测定取不同批次的百金花药材粉末，按“2.3”项下方法处理，进样测定。结果见表1。
表1 百金花中龙胆苦苷和咖啡因的含量测定结果（略）
3 讨论
在《中国药典》Ⅰ部2005年版收载的“龙胆”“秦艽”及“龙胆泻肝丸”中均测定龙胆苦苷［2］，检测波长分别是270和254 nm，我们针对龙胆苦苷、咖啡因进行紫外光谱扫描，发现在（273±2）nm处有最大吸收，因此将273 nm作为检测波长。
提取药材时，先后以30％甲醇为提取溶媒，分别尝试超声提取60 min、回流提取60 min，从色谱图来看，两种提取方法测定所得供试液的色谱峰基本一致，以测定的龙胆苦苷和咖啡因总量为判定指标，两种方法无显著差别。由于超声提取较回流提取方便，最终选择超声提取。同时还考察了超声提取时间，结果20 min提取完全。
在上述色谱条件下，本实验分别选择了3种不同的流动相：甲醇－水（30∶70）、乙腈－水（12∶88）、甲醇－乙腈－水（10∶10∶80）。结果表明使用3种不同流动相对照品分离均较好，考虑到甲醇较乙腈廉价，选择甲醇－水（30∶70）作为流动相。
百金花作为蒙古族习用药材，在本实验中建立了含量测定的方法，作为分离测定研究尚属首次。因此，本实验方法可以作为今后质量控制及其他方面研究的基础，以更好地开发这一蒙药植物资源。
【参考文献】
［1］ 朱亚民.内蒙古植物药志［M］.呼和浩特：内蒙古人民出版社，1989：354.
［2］ 国家药典委员会. 中国药典，Ⅰ部［S］.北京：人民卫生出版社，2005：64,190,416.