点击显示 收起
【摘要】 目的应用高效液相色谱（HPLC）法测定乌梅药材中齐墩果酸和熊果酸的含量，并以齐墩果酸和熊果酸为指标成分建立乌梅肉的质量标准。方法采用Hypersil ODS C18(150 mm×4.6 mm, 5 μm)；甲醇－0.2%乙酸铵水溶液（83∶17）为流动相；检测波长210 nm，流速0.8 ml/min，柱温25℃。结果齐墩果酸的线性范围为0.168～1.512 μg，r＝0.999 6，回收率为98.00%（RSD=0.53%）；熊果酸的线性范围为0.452～4.068 μg，r=0.999 9，回收率为97.13%（RSD=1.17%）。结论该方法简便、可靠、准确，可用于乌梅药材中齐墩果酸和熊果酸的含量比较和乌梅肉的质量控制。
【关键词】 高效液相色谱法 乌梅肉 齐墩果酸 熊果酸
Abstract：ObjectiveTo determine the ursolic acid and oleanolic acid in the pulp of Fructus Mume by HPLC. MethodsThe ursolic acid and oleanolic acid were separated on C18 column.Methanol-0.2% Ammonium acetate solution (83∶17) was used as mobile phase and the detection wavelength was 254nm.ResultsThe linearity of ursolic acid and oleanolic acid was in the range of 0.168～1.512μg, 0.452～4.068μg, respectively; the average recoveries of ursolic acid and oleanolic acid were 98.00%(RSD=0.53%,n=5) and 97.13%(RSD=1.17%,n=5). ConclusionThe method is simple, quick and reproducible，and it can be used for the quality control of the pulp of Fructus Mume.
Key words：HPLC; Pulp of Fructus Mume; Ursolic acid; Oleanolic acid
乌梅，别名酸梅、黑梅，由蔷薇科植物梅Prunus mume (Sieb.) Sieb. et Zucc.（Armeniaca mume Sieb.）的干燥近成熟果实加工而成。关于乌梅的入药方式，历代本草记载有去核和连核使用两种，现代研究证明乌梅中有效成分有机酸及水浸出物大多集中在果肉中，核含量甚少［1］，且核仁含大量脂肪油成分，具滑泄作用，与乌梅的固涩作用相驳；同时也有报道认为乌梅核特征明显，有利于乌梅的鉴定，而且乌梅核还含有约5％的有机酸，且去核繁琐费时费工［2］，所以乌梅是否应分部位药用仍存在争议。《中国药典》Ⅰ部（2005年版）中，净乌梅和乌梅肉都有收载［3］。因此明确乌梅的入药方式，是建立乌梅规范的质量标准的前提。本课题组前期对乌梅各部位的化学成分进行了初步比较研究，结果表明乌梅各部位的药理作用不同，代表乌梅涩肠止泻作用的主要药用部位为乌梅果肉。本实验以齐墩果酸和熊果酸为对照品，建立了乌梅果肉中齐墩果酸和熊果酸的RP-HPLC含量测定方法，为乌梅肉的质量标准的规范奠定了基础。
1 仪器与试剂
1.1 仪器
岛津LC-10A高效液相色谱仪，岛津工作站（日本岛津公司）；高效液相色谱柱［Hypersil-ODS C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），大连依利特公司］；BP211D（十万分之一），BP121S（万分之一）型电子分析天平（德国Sartorius公司）；BUG25-12超声波清洗机（25 kHz,500 W,上海必能信超声波有限公司）。
1.2 试剂
齐墩果酸对照品（中国药品生物制品检定所，供含量测定，批号：709-8501），熊果酸对照品（中国药品生物制品检定所，供含量测定，批号：110742-200314）。甲醇为色谱纯,水为超纯水；其余试剂均为分析纯。
1.3 样品
药材采或购自不同产地，均经鉴定。
2 方法与结果
2.1 色谱条件及系统适应性实验
色谱柱为Hypersil ODS C18(150 mm×4.6 mm, 5 μm)； 流动相为甲醇－0.2%乙酸铵水溶液（83∶17）；检测波长为210 nm；流速0.8 ml/min，柱温25℃。在此条件下分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各5 μl注入液相色谱仪。结果，对照品采用峰面积归一化法计算，二者含量>98％。在此色谱条件可将供试品溶液中齐墩果酸、熊果酸与其它成分峰分离，分离度达1.2，理论塔板数应不低于3 000。对照品溶液、供试品溶液的色谱图见图1～2。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取齐墩果酸对照品10.50 mg，置25 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为齐墩果酸对照品储备液。精密称取熊果酸对照品11.31 mg，置10 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为熊果酸对照品储备液。分别从两种储备液中精密量取1ml溶液，置同一5 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得（每毫升含齐墩果酸84 μg，含熊果酸226 μg）。
2.3 供试品溶液的制备
取乌梅果肉粗粉约4 g，精密称定，置具塞三角瓶中，精密加入甲醇50 ml，密塞，称定重量，超声处理（25 kHz,500 W ）50 min，放至室温，再称定重量，以甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液20 ml，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
2.4 标准曲线的绘制
精密吸取对照品溶液2，6，10，14，18 μl 进样，分别以齐墩果酸、熊果酸峰面积积分值（Area）为纵坐标，其含量（Amt）为横坐标，绘制标准曲线。计算回归方程，齐墩果酸的回归方程为A＝493 338(Amt)+10 620，相关系数为r＝0.999 6，齐墩果酸含量在0.168～1.512μg范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。熊果酸回归方程为A＝524917 (Amt)+9640.4，相关系数为0.999 9，熊果酸含量在0.452～4.068 μg范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。
2.5 稳定性实验取乌梅肉药材，依法制备供试品溶液，室温放置，在0，4，8，12，24 h分别进样5 μl，测得齐墩果酸的含量RSD为1.25%，熊果酸的含量RSD为1.46%。实验表明：样品溶液在24 h内基本稳定。
2.6 精密度实验取同一对照品溶液，重复进样5次，每次5μl，齐墩果酸峰面积积分值的RSD为0.53%，熊果酸峰面积积分值的RSD为1.17%。表明精密度符合要求。
2.7 重复性实验取样品适量，精密称取5份，分别按“2.3”项下的方法操作，分别测定齐墩果酸、熊果酸含量，测得齐墩果酸的含量RSD为2.10%，熊果酸的含量RSD为1.57%。
2.8 加样回收率实验
取乌梅果肉粉末5份，每份约2 g，精密称定，精密加入齐墩果酸对照品0.464 mg，熊果酸对照品1.895 mg，以后按供试品溶液制备方法制备供试液，精密吸取续滤液5 μl，对照品溶液5 μl，分别注入液相色谱仪，测定含量，计算加样回收率（本品另同时测定，含齐墩果酸0.2451 mg/g，熊果酸0.885 5 mg/g）。平均回收率齐墩果酸为98.00%，熊果酸为97.13%。
2.9 乌梅不同入药部位的测定
分别取乌梅核壳和种子粉末各约4 g，按供试品溶液的制备方法制成供试液，按上述色谱条件分别精密吸取乌梅果肉供试品溶液、乌梅核壳供试品溶液、乌梅种仁供试品溶液各5μl注入液相色谱仪。测定。结果核壳和种子样品在齐墩果酸、熊果酸相对应的保留时间未出峰，与果肉样品HPLC图谱比较，三者有明显区别。乌梅果肉供试品溶液、乌梅核壳供试品溶液、乌梅种仁供试品溶液的色谱图见图2～4。
2.10 不同产地样品测定
按前述方法制备各供试品溶液，按上述色谱条件测定，计算含量。结果见表1。表1 不同产地及品种乌梅肉样品中齐墩果酸、熊果酸含量测定结果（略）
根据11批乌梅果肉样品中齐墩果酸和熊果酸含量测定结果，其中10批样品齐墩果酸和熊果酸的总量在1.0 mg/g以上。
3 讨论
关于乌梅的入药方式一直存在争议。本课题组首先对乌梅各部位即果肉、核壳、种仁的药理作用进行了初步比较研究，结果表明乌梅各部位药理作用不同［4］。本实验采用HPLC法对乌梅果肉、核壳和种仁的化学成分进行了比较，结果表明齐墩果酸和熊果酸仅存在于果肉部位，这为乌梅各部位药理作用的差异提供了物质基础依据，进一步证明了乌梅应分部位药用的必要性。提示应分别建立各部位的质量控制标准，保证临床用药的安全有效。
有文献报道乌梅仅含熊果酸而不含齐墩果酸［5］。 本研究首次发现乌梅果肉中齐墩果酸和熊果酸两者同时存在，因此本研究以齐墩果酸和熊果酸为对照品，建立了用乌梅果肉中齐墩果酸和熊果酸的反相HPLC含量测定方法。
【参考文献】
［1］张丽丽,耿小平. 乌梅、醋乌梅等有机酸及水浸物含量比较［J］.山东中医杂志,1999,8(8):370.
［2］胡彩霞,姜世秋.小议乌梅炮制与用量［J］.时珍国药研究,1998,9(1):18.
［3］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］. 北京:化学工业出版社,2005:54.
［4］陈 林,陈鸿平,刘友平.乌梅不同部位药理作用比较研究［J］.中国药房,2007,18(27):2089.
［5］阴 健.中药现代化研究与应用(2)［M］.北京:中医古籍出版社,1995:75.